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Esperimento di Avery

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Esperimento di Avery

L’esperimento di Avery, condotto nel 1944 da Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty, dimostrò che la natura chimica del “principio trasformante” scoperto da Griffith è il DNA, identificandolo univocamente come il depositario dell’informazione genetica della cellula.

Contesto storico e il preconcetto sulle proteine

Prima della pubblicazione dello studio di Avery, la comunità scientifica riteneva che l’informazione genetica risiedesse nelle proteine. Tale convinzione si basava su due argomenti principali:

  1. Complessità dell’alfabeto biologico: Le proteine sono costituite da 20 amminoacidi diversi, mentre gli acidi nucleici presentano solo 4 nucleotidi distinti. Si riteneva che un alfabeto a 20 lettere avesse una capacità di memorizzazione dell’informazione di gran lunga superiore.
  2. Dimensioni molecolari apparenti: Le tecniche di purificazione del tempo frammentavano il DNA in segmenti estremamente corti, portando a ritenere che fosse una molecola troppo piccola e semplice per svolgere funzioni informative, a differenza delle macromolecole proteiche.

Disegno sperimentale in vitro

Avery e collaboratori ottimizzarono il modello sperimentale di Griffith eliminando l’inoculazione murina in vivo e lavorando esclusivamente su colture cellulari in vitro di Streptococcus pneumoniae:

  1. Preparazione dell’estratto acellulare: Cellule virulente di ceppo S vennero uccise al calore e lisate, rilasciando in soluzione tutte le componenti macromolecolari (DNA, RNA, proteine, carboidrati).
  2. Digestione enzimatica selettiva: Il lisato acellulare venne suddiviso in tre aliquote trattate con enzimi idrolitici specifici:
    • Provetta 1 + Proteinasi: Enzimi che degradano selettivamente le proteine. L’estratto risultante contiene DNA e RNA, ma è privo di proteine.
    • Provetta 2 + RNasi: Enzimi che degradano selettivamente l’RNA. L’estratto risultante contiene DNA e proteine, ma è privo di RNA.
    • Provetta 3 + DNasi: Enzimi che degradano selettivamente il DNA. L’estratto risultante contiene RNA e proteine, ma è privo di DNA.
  3. Saggio di trasformazione: Ciascuna miscela digerita fu aggiunta a colture di ceppo R vivo e incubata per osservare l’eventuale comparsa di colonie trasformate di tipo S.

(Integrazione da: sbobina 4)

Controlli sperimentali

I controlli devono essere contemporanei all’esperimento e condotti nelle medesime condizioni sperimentali:

  • Controllo positivo: Aggiunta dell’estratto acellulare intero (non trattato con enzimi) a cellule R vive per verificare che la trasformazione avvenga regolarmente.
  • Controllo negativo: Aggiunta a cellule R vive del tampone di estrazione trattato contemporaneamente con tutti e tre gli enzimi (proteinasi, RNasi, DNasi). Dimostra l’efficacia degli enzimi e l’assenza di trasformazione aspecifica in assenza di macromolecole intatte.
  • Controlli negativi per escludere contaminazioni (secondo la Professoressa):
    1. Piastrare unicamente cellule R vive per escludere mutazioni spontanee o contaminazioni preesistenti da ceppo S.
    2. Piastrare cellule R vive con tutte le soluzioni utilizzate per l’estrazione, ma prive di estratto cellulare, per verificare l’assenza di contaminanti batterici nei reagenti.

Risultati e Conclusioni

  • Miscele prive di proteine o di RNA (Provette 1 e 2): Si osserva la comparsa di colonie batteriche S vive. La trasformazione avviene regolarmente.
  • Miscela priva di DNA (Provetta 3): Non si osserva alcuna trasformazione; rimangono unicamente i batteri benigni di tipo R.

Conclusione

Poiché la degradazione enzimatica del solo DNA previene la trasformazione del ceppo R in S, il DNA è il principio trasformante.

(Integrazione da: sbobina 4)

Meccanismo molecolare della trasformazione

Il genoma di Streptococcus pneumoniae consiste in una molecola di DNA circolare covalentemente chiusa. Tra i vari geni, uno o più geni (cap) sono responsabili della sintesi della capsula polisaccaridica che rende il ceppo S virulento ed in grado di evadere il sistema immunitario dell’ospite.

Durante la preparazione dell’estratto acellulare con uccisione al calore delle cellule S, il DNA genomico batterico viene frammentato. Alcuni di questi frammenti contengono il gene cap integro. Quando l’estratto viene messo a contatto con le cellule di tipo R (prive di capsula a causa di una mutazione):

  1. La cellula di tipo R accoglie il frammento di DNA estraneo contenente il gene selvatico.
  2. Molto raramente, avviene un processo di ricombinazione omologa in cui il frammento ricombina con il genoma dell’ospite, sostituendo il gene mutato con quello selvatico e sano.
  3. Il batterio R viene così stabilmente trasformato in un batterio S in grado di produrre la capsula.

Accoglienza scientifica (“La bomba di Avery”)

Nonostante la robustezza del metodo scientifico impiegato, la pubblicazione dei risultati (spesso ricordata come “la bomba di Avery”) fu inizialmente accolta con scetticismo e rifiutata da gran parte dei biologi dell’epoca, ancora fortemente ancorati al dogma che identificava nelle proteine la sede del codice genetico.

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