Rimozione dei Primer nella Replicazione

La presenza di sequenze di RNA (primer) all’interno del filamento di DNA neosintetizzato compromette la stabilità chimica e strutturale della doppia elica. Pertanto, al termine della replicazione, tutti gli inneschi di RNA devono essere rimossi e sostituiti con DNA, e i frammenti adiacenti devono essere saldati.

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Via Procariotica

Nei procarioti, la rimozione dell’innesco di RNA e la saldatura del filamento avvengono tramite la cooperazione di tre enzimi:

1. RNAsi H (Hybrid): Riconosce gli ibridi stabili RNA-DNA e idrolizza i legami fosfodiesterici tra i nucleotidi del primer di RNA. La RNAsi H rimuove quasi tutto il primer, ma non è in grado di idrolizzare il legame chimico dell’ultimo ribonucleotide (NTP) unito covalentemente al primo deossiribonucleotide (dNTP) del frammento di DNA.
2. DNA Polimerasi I:
   • Tramite la sua attività esonucleasica in direzione $5^{\prime }\to 3^{\prime }$, rimuove l’ultimo NTP residuo rimasto adeso al DNA.
   • Tramite la sua attività polimerasica $5^{\prime }\to 3^{\prime }$, riempie il vuoto (gap) generato dalla rimozione del primer sintetizzando DNA a partire dall’estremità 3’-OH libera del frammento di Okazaki precedente.
3. DNA Ligasi: Catalizza la formazione del legame fosfodiesterico finale tra l’estremità 3’-OH dell’ultimo nucleotide inserito dalla DNA polimerasi I e l’estremità 5’-fosfato del frammento di DNA successivo, saldando l’interruzione (nick).

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Via Eucariotica

Negli eucarioti, il processo non coinvolge la DNA polimerasi I ma si basa sul meccanismo dello switch delle polimerasi e sulla formazione di una struttura a lembo (flap):

1. Switch delle Polimerasi:
   • La primasi sintetizza il primer di RNA.
   • La DNA polimerasi $\alpha$ si attiva ed estende il primer di RNA inserendo una breve sequenza di circa 20-30 nucleotidi di DNA.
   • Il complesso proteico sliding clamp (PCNA) si lega alla giunzione innesco-stampo e recluta la DNA polimerasi $\delta$ (polimerasi replicativa altamente processiva), sostituendo la DNA polimerasi $\alpha$. Questo passaggio di enzimi è definito switch.
2. Generazione del Flap: La DNA polimerasi $\delta$ procede sintetizzando il frammento di Okazaki. Quando incontra l’innesco del frammento di Okazaki precedente, non si ferma: continua la sintesi spostando lateralmente e sollevando l’innesco di RNA (e la prima porzione di DNA sintetizzata da pol $\alpha$). Si viene così a creare una struttura a singolo filamento sporgente, detta flap.
3. Taglio del Flap (FEN1): L’enzima endonucleasi FEN1 (Flap Endonuclease 1) taglia specificamente alla base del flap sporgente, rimuovendo sia il primer di RNA che la porzione contigua di DNA.
4. Saldatura (Ligasi): La DNA ligasi interviene per saldare il nick rimasto, congiungendo in modo covalente i due frammenti adiacenti.

Importanza Biologica della Rimozione del DNA di Pol $\alpha$

Il meccanismo di rimozione del flap rimuove non solo il primer di RNA, ma anche il tratto iniziale di DNA sintetizzato dalla DNA polimerasi $\alpha$. Questo passaggio è fondamentale per preservare l’accuratezza del genoma: la DNA polimerasi $\alpha$ è priva di attività di proofreading e pertanto presenta una fedeltà di copia molto inferiore rispetto alle polimerasi replicative $\delta$ ed $\epsilon$. La rimozione sistematica del DNA sintetizzato da pol $\alpha$ previene l’accumulo di mutazioni nel filamento neosintetizzato.

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🔗 Collegamenti

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• Accuratezza della Replicazione del DNA — 🔗 stesso meccanismo