DNA Polimerasi

Le DNA polimerasi sono enzimi responsabili della sintesi di nuovi filamenti di DNA a partire da un filamento stampo, catalizzando la formazione di legami fosfodiesterici tra i deossiribonucleotidi (dNTP).

---

Classificazione

DNA Polimerasi nei Procarioti

I procarioti possiedono 5 tipi differenti di DNA polimerasi:

• DNA Polimerasi I (polA): Scoperta da Kornberg nel 1957. L’inattivazione del gene polA (knock-out) non è letale per la cellula batterica, in quanto la replicazione prosegue. Partecipa alla duplicazione del DNA rimuovendo i primer di RNA e riempiendo i gap rimasti.
• DNA Polimerasi II (polB): Enzima coinvolto principalmente nei meccanismi di riparazione del DNA. La sua inattivazione non è letale.
• DNA Polimerasi III: Isolata nel 1972, è la principale DNA polimerasi replicativa batterica. La sua inattivazione genica è letale (i batteri non crescono). Ha una struttura complessa a più subunità definita oloenzima.
• DNA Polimerasi IV e V: Enzimi specializzati coinvolti nei meccanismi di riparazione del DNA.

Tutte le DNA polimerasi batteriche possiedono attività polimerasica in direzione $5^{\prime }\to 3^{\prime }$. Molte di esse presentano anche un’attività esonucleasica $3^{\prime }\to 5^{\prime }$ (proofreading) e/o $5^{\prime }\to 3^{\prime }$. Hanno tutte struttura monomerica semplice, ad eccezione della DNA polimerasi III.

DNA Polimerasi negli Eucarioti

Negli eucarioti sono state identificate 15-16 DNA polimerasi, suddivise in due categorie funzionali:

1. DNA Polimerasi Replicative (DNA pol $\delta$, DNA pol $\epsilon$, DNA pol $\alpha$):
   • Sono gli unici tre enzimi direttamente coinvolti nel processo di duplicazione del genoma nucleare.
   • Sono dotate di attività di proofreading.
   • Sono altamente processive (sintetizzano lunghi tratti di DNA senza staccarsi dallo stampo).
2. DNA Polimerasi Specializzate:
   • Hanno funzioni specifiche al di fuori della duplicazione genomica principale (ad esempio, la DNA pol $\gamma$ è responsabile della replicazione del DNA mitocondriale).
   • Non sono dotate di attività di proofreading (quindi sono error-prone).
   • Non sono processive.

---

Struttura della DNA Polimerasi

Indipendentemente dall’organismo di origine, la struttura tridimensionale della DNA polimerasi è altamente conservata ed è paragonabile a una mano destra:

• Dominio del Palmo (Palm): È la sede del sito catalitico dove passa il DNA. È responsabile dell’attività polimerasica (formazione del legame fosfodiesterico) e dell’attività di proofreading.
• Dominio delle Dita (Fingers): Include il sito di legame per i dNTP ed è coinvolto nel garantire il corretto appaiamento tra il dNTP entrante e il filamento stampo.
• Dominio del Pollice (Thumb): Svolge una funzione strutturale ripiegandosi sul DNA, stabilizzando il complesso formato dal DNA stampo e dall’enzima.

---

Formazione del Legame Fosfodiesterico

La sintesi del legame fosfodiesterico avviene tramite un attacco nucleofilo del gruppo ossidrilico ($-\text{OH}$) legato al carbonio 3’ (C3) dell’ultimo nucleotide del filamento nascente verso il fosforo $\alpha$ (P$\alpha$) legato al carbonio 5’ (C5) del deossiribonucleotide trifosfato (dNTP) entrante.

Questo attacco rompe il legame anidridico tra il fosfato $\alpha$ e il fosfato $\beta$ del dNTP, determinando il rilascio di una molecola di pirofosfato (costituita dai gruppi fosfato $\beta$ e $\gamma$). All’interno della cellula, enzimi detti pirofosfatasi idrolizzano immediatamente il pirofosfato in due fosfati inorganici, impedendone l’accumulo e rendendo la reazione di polimerizzazione irreversibile ed energeticamente favorita.

---

Meccanismo Catalitico e Selezione Nucleotidica

La DNA polimerasi non è in grado di leggere direttamente la base sul filamento stampo per selezionare attivamente il nucleotide complementare; l’enzima consente l’accesso a qualsiasi dNTP libero nel sito attivo:

• Se il dNTP entrante non è complementare, l’interazione con il filamento stampo è debole e instabile, e il nucleotide viene rapidamente rilasciato.
• Se il dNTP entrante è complementare, si stabilisce un’interazione idonea che aumenta il tempo di permanenza del nucleotide nel sito attivo. Questo induce un cambiamento conformazionale nel dominio delle dita, che si piega di circa 40° per coprire il sito catalitico e posizionare correttamente i reagenti per la catalisi.

Questo processo prende il nome di meccanismo catalitico indotto dalla conformazione o selezione cinetica.

Ruolo dei Cofattori Metallici

Nel sito catalitico della DNA polimerasi sono coordinati due ioni magnesio (${\text{Mg}}^{2+}$) da parte di residui amminoacidici carichi negativamente (aspartato e glutammato). Gli ioni ${\text{Mg}}^{2+}$:

1. Orientano e organizzano spazialmente il dNTP entrante.
2. Contribuiscono alla deprotonazione del gruppo $-\text{OH}$ in 3’ del nucleotide terminale, facilitando l’attacco nucleofilo.

Selezione dNTP vs NTP

Nonostante la concentrazione intracellulare di ribonucleotidi (NTP) sia superiore rispetto a quella dei deossiribonucleotidi (dNTP), l’incorporazione di un NTP comprometterebbe la stabilità del filamento di DNA. La DNA polimerasi discrimina i dNTP dagli NTP tramite la presenza di un residuo di tirosina (Tyr) nel proprio sito catalitico:

• L’anello aromatico della tirosina crea un ingombro sterico specifico con il gruppo $-\text{OH}$ presente sul C2 del ribosio degli NTP.
• Questo impedisce il corretto posizionamento del nucleotide errato nel sito catalitico, escludendolo.

---

Processività e Caricamento della Pinza

La sintesi del DNA può avvenire secondo due modalità cinetiche:

• Sintesi Distributiva: L’enzima si stacca e si riaggancia continuamente al filamento dopo ogni reazione di polimerizzazione (energeticamente sfavorevole e lenta).
• Sintesi Processiva: L’enzima scivola continuamente lungo il filamento stampo aggiungendo nucleotidi senza mai dissociarsi dal DNA.

La processività delle DNA polimerasi replicative è garantita da specifiche strutture proteiche ad anello che avvolgono il DNA:

• Pinza $\beta$: Nei procarioti, mantiene la DNA polimerasi III legata al DNA.
• PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen): Negli eucarioti, ancora la DNA pol $\epsilon$ e la DNA pol $\delta$ al filamento stampo. È un noto marcatore diagnostico tumorale data la sua forte espressione nelle cellule in attiva proliferazione.

Il posizionamento della pinza sul DNA è mediato dal caricatore della pinza (clamp loader), un complesso proteico ad attività ATP-asica: l’idrolisi dell’ATP fornisce l’energia necessaria per aprire la pinza ad anello, posizionarla a ridosso dell’innesco a singolo filamento e richiuderla attorno alla doppia elica.

---

Inibitori Farmacologici della DNA Polimerasi

L’attività della DNA polimerasi può essere bloccata selettivamente mediante molecole esogene:

• Antimetaboliti (Chemioterapici): Sono analoghi strutturali dei dNTP privi del gruppo ossidrilico ($-\text{OH}$) in posizione 3’. Quando la DNA polimerasi delle cellule tumorali li incorpora, la sintesi del DNA si arresta (chiamata terminazione di catena) a causa dell’impossibilità di formare il successivo legame fosfodiesterico. Il limite di questi farmaci è la ridotta specificità per le sole cellule neoplastiche rispetto alle cellule sane in attiva divisione.
• Farmaci Antivirali (es. Aciclovir): L’Aciclovir è un analogo aciclico della guanosina. Viene incorporato selettivamente dalla DNA polimerasi virale (ad esempio nei virus dell’Herpes), determinando il blocco della replicazione del genoma virale.

---

🔗 Collegamenti

• Replicazione del DNA — 📋 fa parte di
• Accuratezza della Replicazione del DNA — 🔗 stesso meccanismo
• Forcella Replicativa — 🔗 stesso meccanismo
• Rimozione dei Primer nella Replicazione — ⬇️ conseguenza
• Topoisomerasi — 🔄 confronto