Topoisomerasi
Le topoisomerasi sono enzimi nucleari deputati a risolvere il problema topologico del DNA. Vengono reclutate nel macchinario replicativo per rilassare la doppia elica, controbilanciando i superavvolgimenti positivi accumulati davanti alla forcella replicativa.
Meccanismo d’Azione Generale
Per variare il numero di legame (), le topoisomerasi catalizzano una reazione in tre fasi:
- Taglio dello scheletro zucchero-fosfato del DNA.
- Passaggio del/i filamento/i attraverso il varco creato o rotazione.
- Risaldatura del taglio.
Il Covalente Tirosina-DNA
Un taglio netto del DNA a singolo o doppio filamento verrebbe intercettato dai sistemi cellulari di riparazione del danno al DNA, innescando l’arresto del ciclo o l’apoptosi. Per evitare ciò, le topoisomerasi si mantengono saldamente legate al DNA durante la reazione: il loro sito catalitico possiede un residuo dell’amminoacido tirosina il cui gruppo ossidrilico () effettua un attacco nucleofilo sul legame fosfodiesterico del DNA, formando un legame covalente transitorio fosfo-tirosinico. Questo preserva l’energia del legame chimico per la risaldatura finale, che avviene senza necessità di energia esterna.
Azione Difettiva come Danno al DNA
Qualora l’azione delle topoisomerasi risulti incompleta — ossia l’enzima compia il taglio dello scheletro zucchero-fosfato ma non riesca a risaldarlo — il complesso covalente transitorio decade o rimane bloccato. Questo lascia interruzioni permanenti a singolo o doppio filamento nella doppia elica. In queste circostanze, l’enzima si comporta di fatto come un agente mutageno biologico endogeno, arrecando un danno diretto che, se non riparato, può innescare l’apoptosi o favorire alterazioni genomiche (in modo del tutto analogo all’azione di nucleasi che tagliano in modo non programmato).
Classificazione delle Topoisomerasi
1. Topoisomerasi I
- Caratteristiche: Non richiedono l’idrolisi di ATP per la loro attività catalitica. Tagliano un solo filamento della doppia elica.
- Sottoclassi:
- Topoisomerasi IA: Tagliano un singolo filamento e fanno passare il filamento complementare integro attraverso il varco creato prima di risaldare. Riducono il valore di di una unità alla volta ().
- Topoisomerasi IB: Tagliano un singolo filamento e consentono alle estremità tagliate di ruotare liberamente attorno al filamento integro. Riducono il valore di di una unità alla volta con un meccanismo molecolare basato sulla rotazione controllata.
2. Topoisomerasi II
- Caratteristiche: Richiedono l’idrolisi di ATP per compiere il ciclo conformazionale. Tagliano entrambi i filamenti della doppia elica del DNA.
- Funzione: Fanno passare una doppia elica integra attraverso il taglio a doppio filamento creato in un’altra porzione di DNA. Possono rilassare superavvolgimenti (variando di due unità alla volta) oppure, in alcuni casi come la girasi batterica, introdurre attivamente superavvolgimenti negativi.
Analisi in Vitro dell’Attività Topoisomerasica
L’attività delle topoisomerasi può essere monitorata sperimentalmente in vitro utilizzando molecole di DNA circolare chiuso (es. plasmidi) e analizzandone la mobilità elettroforetica tramite Elettroforesi su Gel di agarosio.
La velocità di migrazione del DNA nel gel risponde a due parametri fisici:
- Massa: Molecole più piccole migrano più rapidamente (massa costante in questo saggio).
- Forma (Compattezza): Molecole con struttura tridimensionale più compatta (ossia altamente superavvolte) incontrano meno resistenza nella matrice del gel e migrano molto più velocemente rispetto a molecole rilassate (circolari aperte o lineari).
Il Saggio di Rilassamento
In provetta si miscela il DNA plasmidico superavvolto con quantità crescenti di topoisomerasi. All’aumentare della concentrazione o del tempo di reazione dell’enzima, il DNA viene progressivamente rilassato. Di conseguenza, all’analisi elettroforetica si osserva un progressivo rallentamento della corsa elettroforetica del DNA, che si risolve in una serie di bande distinte corrispondenti ai diversi topoisomeri (ciascuno differisce per un singolo valore di ) fino al DNA completamente rilassato.
(Integrazione da: sbobina 22)
🔗 Collegamenti
- Topologia del DNA — ⬆️ causa
- Inibitori delle Topoisomerasi — ➡️ evoluzione
- Elettroforesi su Gel — 🔬 reperto diagnostico
- Enzimi — 📋 fa parte di