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Elettroforesi su Gel

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Elettroforesi su Gel

L’elettroforesi su gel (dal greco elektron e phoresis “correre in un campo elettrico”) è una tecnica analitica di laboratorio utilizzata per separare e analizzare macromolecole (DNA, RNA o proteine) in base alla loro dimensione e alla loro carica elettrica attraverso una matrice gelificata porosa sottoposta a un campo elettrico.

Mentre la spettrofotometria misura la concentrazione di un campione, l’elettroforesi ne valuta l’integrità e la composizione dimensionale.

Matrici di Gelizzazione

  • Gel di Agarosio: L’agarosio è un polimero polisaccaridico lineare estratto dalle alghe. Si prepara sciogliendo la polvere in un tampone caldo; raffreddandosi (sotto i 60 °C) si solidifica formando una gelatina. La densità delle maglie (dimensione dei pori) dipende dalla concentrazione percentuale di agarosio scelta. È impiegato principalmente per frammenti di acidi nucleici di medie e grandi dimensioni.
  • Gel di Poliacrilammide (PAGE): Presenta maglie e pori estremamente stretti e uniformi. Consente una separazione ad altissima risoluzione, potendo distinguere frammenti che differiscono per un singolo nucleotide (tecnica fondamentale per il sequenziamento del DNA).

Preparazione dei Pozzetti e Caricamento

Prima che la soluzione liquida del gel solidifichi del tutto, si inseriscono dei pettini dotati di denti. Una volta che il gel si è solidificato, i pettini vengono rimossi delicatamente lasciando delle cavità verticali chiamate pozzetti, all’interno dei quali verranno pipettati i campioni da analizzare.

Principio di Migrazione Elettroforetica

  1. Il gel viene immerso in una cella elettroforetica contenente una soluzione salina conduttrice (tampone di corsa).
  2. Viene applicata una differenza di potenziale elettrico mediante un generatore.
  3. Gli acidi nucleici (carichi negativamente a causa dei gruppi fosfato dello scheletro zucchero-fosfato) migrano forzatamente dal polo negativo (catodo) verso il polo positivo (anodo).
  4. La matrice porosa del gel funge da setaccio molecolare opponendo attrito meccanico: i frammenti più piccoli attraversano agevolmente i pori e migrano più velocemente, mentre i frammenti più grandi sono rallentati e si spostano più lentamente.
  5. Al termine della corsa elettroforetica, le molecole si distribuiscono in bande discrete ordinate per peso molecolare decrescente a partire dai pozzetti.

Visualizzazione delle Bande

Poiché gli acidi nucleici non sono colorati, per renderli visibili si utilizzano coloranti fluorescenti intercalanti carichi negativamente, come il bromuro di etidio o il Sybr Safe. Queste molecole si inseriscono tra le basi azotate degli acidi nucleici e, se eccitate con luce ultravioletta o blu, emettono fluorescenza rivelando la posizione esatta delle bande.

Il bromuro di etidio si intercala tra i pioli della doppia elica, alterandone profondamente la conformazione tridimensionale e compromettendo la stabilità genomica. Per questo motivo è una sostanza altamente tossica e mutagena. In laboratorio viene oggi sostituito da molecole più sicure, come il Sybr Safe, che presenta un meccanismo analogo di intercalazione ma permea molto più difficilmente attraverso le membrane dei tessuti biologici.

Elettroforesi dell’RNA

L’analisi elettroforetica dell’RNA presenta sfide specifiche rispetto a quella del DNA:

Instabilità e Purificazione

L’RNA è estremamente instabile ed esposto a rapida degradazione enzimatica per via dei suoi gruppi ossidrilici () reattivi in posizione 2’ del ribosio, che lo rendono vulnerabile alle ribonucleasi (RNasi). La purificazione e la manipolazione richiedono condizioni sterili rigorose, l’uso di provette e reagenti specifici certificati RNase-free.

Conformazioni e Denaturazione

Il DNA a doppia elica ha una conformazione rigida e uniforme, per cui la sua migrazione dipende esclusivamente dalla lunghezza del frammento. L’RNA a singolo filamento tende invece a formare strutture secondarie e terziarie intramolecolari complesse (anse, forcine) che ne alterano la forma spaziale. Per evitare che la conformazione tridimensionale influenzi la migrazione, l’elettroforesi dell’RNA deve essere eseguita in condizioni denaturanti (gel contenenti agenti denaturanti) in modo da mantenere le molecole in forma lineare durante la corsa.

Specie di RNA e Valutazione dell’Integrità

In una corsa elettroforetica di RNA totale estratto, le componenti visibili a occhio nudo sono:

  • RNA Ribosomiale (rRNA): Costituisce la frazione nettamente più abbondante dell’RNA cellulare totale.
  • tRNA e mRNA: L’mRNA è presente in quantità minime e appare come un alone di fondo (smear), mentre i tRNA migrano molto in avanti per via delle loro dimensioni ridotte.
  • Le due Bande di rRNA: L’integrità del campione viene stimata osservando la nitidezza e il rapporto di intensità delle due bande distinte corrispondenti all’rRNA della subunità maggiore e della subunità minore dei ribosomi.

Elettroforesi delle Proteine e Denaturazione

(Argomenti citati a fine lezione e approfonditi tramite didattica online)

(Integrazione da: sbobina 26)

A differenza degli acidi nucleici, le cui molecole hanno una carica negativa uniforme e proporzionale alla loro massa (dovuta allo scheletro zucchero-fosfato), le proteine presentano cariche elettriche nette estremamente variabili e non prevedibili, che dipendono dalla loro specifica composizione in amminoacidi acidi o basici. Inoltre, le proteine possiedono strutture secondarie, terziarie o quaternarie che ne influenzano la forma spaziale, alterando la migrazione nel gel indipendentemente dalla massa molecolare.

Per separare le proteine basandosi esclusivamente sulla loro dimensione (peso molecolare), si utilizza la tecnica SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato):

  1. Denaturazione: I campioni proteici vengono riscaldati e trattati con agenti denaturanti per rompere i ripiegamenti tridimensionali, riportando le catene polipeptidiche allo stato lineare di struttura primaria.
  2. Trattamento con SDS: Il sodio dodecil solfato (SDS) è un detergente anionico forte dotato di una lunga coda alifatica idrofobica e di una testa idrofila carica negativamente. Le code idrofobiche dell’SDS si avvolgono e si associano strettamente lungo la catena polipeptidica denaturata in modo proporzionale alla sua lunghezza.
  3. Omogeneizzazione della Carica: Le teste cariche negativamente dell’SDS si espongono verso l’esterno, conferendo a tutte le proteine denaturate una forte carica negativa netta uniforme e un rapporto carica/massa costante.
  4. Corsa Elettroforetica: Sotto l’azione di un campo elettrico, tutte le proteine rivestite di SDS migrano forzatamente all’anodo (+) attraverso le maglie strette del gel di poliacrilammide. La velocità di migrazione dipenderà esclusivamente dal peso molecolare (le proteine più piccole migrano più rapidamente).

Applicazione Sperimentale: Analisi degli Istoni Core

L’SDS-PAGE è stata essenziale per determinare la composizione proteica del Nucleosoma:

  • Gli istoni purificati e dissociati dal DNA sono stati analizzati tramite SDS-PAGE.
  • Poiché gli istoni sono proteine fortemente basiche (cariche positivamente), la loro carica naturale avrebbe impedito la migrazione corretta verso l’anodo. Il rivestimento con SDS ha annullato questa variabilità.
  • Al termine del processo, sono state identificate solamente 4 bande distinte di pari intensità cromatica, dimostrando che l’ottamero istonico del nucleosoma è costituito da quattro proteine differenti in quantità stechiometriche identiche (H2A, H2B, H3 e H4).

Applicazione nello Studio di Topoisomeri e Topoisomerasi

L’elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica fondamentale per studiare in vitro le modificazioni topologiche del DNA circolare (come i plasmidi) e caratterizzare l’attività delle Topoisomerasi.

Mentre per i frammenti di DNA lineare la migrazione dipende esclusivamente dalla lunghezza/massa molecolare, nel DNA circolare la mobilità elettroforetica è fortemente influenzata dalla forma (compattezza) e dal grado di superavvolgimento:

  • DNA Superavvolto: Presenta una conformazione tridimensionale estremamente compatta, che incontra meno attrito meccanico nel gel e migra molto velocemente.
  • DNA Rilassato (o Circolare Aperto): Presenta una conformazione spaziale distesa che fa fatica ad attraversare i pori del gel, migrando molto più lentamente.

Saggio di Rilassamento delle Topoisomerasi

Miscelando in provetta del DNA plasmidico superavvolto con quantità crescenti di topoisomerasi, si assiste al progressivo rilassamento dei superavvolgimenti. All’analisi elettroforetica si osserva un rallentamento della corsa elettroforetica del DNA, visualizzabile come una serie di bande distinte corrispondenti ai diversi topoisomeri (che differiscono per il valore del numero di legame ) fino al DNA completamente rilassato.

(Sezione espansa con: sbobina 22, sbobina 26)

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