Falsa Omozigosi
La falsa omozigosi (o dropout allelico) è l’errore diagnostico per cui un eterozigote viene refertato come omozigote, perché la tecnica usata “vede” un solo allele e non si accorge che il secondo è assente o non amplificabile. È la trappola classica nella ricerca di una delezione eterozigote (vedi Mutazioni).
Perché Succede: Sequenza vs Dosaggio
La PCR qualitativa e il sequenziamento Sanger leggono quale sequenza è presente, non quante copie ce ne sono:
- In un eterozigote con un allele deleto, l’allele normale rimasto viene amplificato lo stesso → la PCR dà esito positivo/presente.
- Il sequenziamento legge solo l’allele superstite → risultato apparentemente omozigote sano.
Il difetto non è dell’esecuzione, ma del tipo di informazione: presenza/sequenza non distinguono 1 copia da 2 copie. Per intercettare la delezione serve un metodo sensibile al dosaggio.
Come si Smaschera
Metodi che contano o misurano fisicamente le copie a un locus:
- Ibridazione in situ Fluorescente (FISH): una delezione eterozigote dà un solo segnale invece di due (per delezioni grandi, dalla microdelezione al gene intero).
- Southern Blot: la delezione altera dimensione/presenza della banda di restrizione.
- MLPA, qPCR, array-CGH: quantificano il numero di copie e prendono anche delezioni più piccole.
Calibrazione: una delezione piccola (es. frameshift di pochi nucleotidi) è invisibile alla FISH e va cercata con sequenziamento/MLPA; una delezione grande è il bersaglio ideale dei metodi di dosaggio fisico.
Nota: l’X Inattivo Non C’entra
In una portatrice femmina, il fatto che l’allele deleto stia sull’X inattivo (corpo di Barr) non rende la delezione più difficile da rilevare: l’inattivazione è epigenetica (condensazione, metilazione) e non altera la sequenza del DNA. La delezione resta un’assenza fisica di sequenza, indipendente dallo stato attivo/inattivo del cromosoma.
🔗 Collegamenti
- Ibridazione in situ Fluorescente (FISH) — 🔗 stesso meccanismo / stessa via
- Southern Blot — 🔗 stesso meccanismo / stessa via
- Mutazioni — ⬆️ causa
- Elettroforesi su Gel — 📋 fa parte di