Ibridazione in situ Fluorescente (FISH)
La FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) è una tecnica di citogenetica molecolare che permette di visualizzare e localizzare la presenza, la posizione fisica e il numero di copie di specifiche sequenze di DNA direttamente su preparati cellulari (cromosomi metafasici o nuclei interfasici).
Principio e Fasi della Tecnica
La definizione “in situ” deriva dal fatto che l’ibridazione avviene direttamente su vetrino portaoggetti dove sono fissate le cellule o i cromosomi, consentendo l’analisi al microscopio a fluorescenza.
La metodica prevede 4 passaggi principali:
- Preparazione della Sonda Fluorescente: Sintesi di una sonda a singolo filamento complementare alla sequenza target, coniugata con molecole fluorocrome.
- Denaturazione: Trattamento termico o chimico del vetrino (DNA target) e della sonda per separare i doppi filamenti in singoli filamenti.
- Ibridazione: Incubazione della sonda sul vetrino per permettere l’appaiamento complementare tra sonda e target.
- Rilevamento del Segnale: Osservazione al microscopio a fluorescenza per identificare i segnali luminosi emessi dai fluorocromi.
Applicazioni Diagnostiche
La FISH viene utilizzata clinicamente per rilevare anomalie cromosomiche numeriche e strutturali:
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Diagnosi di Aberrazioni Cromosomiche:
- Delezioni: Assenza del segnale fluorescente specifico per una determinata sonda.
- Inversioni: Alterazione dell’ordine sequenziale dei segnali di sonde diverse lungo lo stesso cromosoma.
- Traslocazioni: Presenza del segnale di una sonda specifica su un cromosoma differente da quello atteso.
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Rilevamento delle Variazioni del Numero di Copie (CNV) e Duplicazioni: Consente di contare fisicamente il numero di copie di un gene o di un intero cromosoma.
- Esempio clinico di duplicazione genica sul cromosoma X: In maschi analizzati per sospetta sindrome di duplicazione legata all’X (identificati da un singolo segnale verde per il cromosoma X), la presenza di 2 o 3 segnali per il gene target (rispetto al singolo segnale atteso) diagnostica la patologia.
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Ambiti Clinici Generali: Diagnosi prenatale, diagnosi genetica preimpianto (PGD), analisi postnatale di mosaici e sindromi cromosomiche, e caratterizzazione delle alterazioni cariotipiche nei tumori.
Vantaggi Diagnostici rispetto al Sequenziamento
- Dosaggio Genico: Il sequenziamento del DNA rileva la sequenza nucleotidica wild-type (one-type) ma non fornisce informazioni dirette sul numero di copie fisiche di un gene o di un cromosoma. Pertanto, per diagnosticare trisomie (es. Sindrome di Down) o duplicazioni geniche, si prescrive la FISH e non il sequenziamento genetico.
🔗 Collegamenti
- Ibridazione degli Acidi Nucleici — 📋 fa parte di
- Gene — 🔄 diagnosi differenziale / confronto
- Tassonomia — 🔗 stesso meccanismo / stessa via