Southern Blot

Il Southern Blot è stata la prima tecnica molecolare a sfruttare l’ibridazione degli acidi nucleici con sonde marcate. Permette di rilevare la presenza, la quantità e la dimensione di una specifica sequenza di DNA all’interno di una miscela complessa (es. genoma purificato).

Procedura Sperimentale

La metodica si articola nelle seguenti fasi:

1. Estrazione e Purificazione: Il DNA genomico viene isolato dal campione biologico.

2. Digestione Enzimatica: Il DNA viene digerito tramite Enzimi di Restrizione. A causa dell’elevato numero di frammenti generati, l’elettroforesi produrrà una “strisciata” continua (smear) in cui i singoli frammenti non sono distinguibili ad occhio nudo.

3. Elettroforesi su Gel: I frammenti di restrizione vengono separati per dimensione su un gel di agarosio.

4. Denaturazione: Il gel viene immerso in una soluzione basica (alto pH). L’alcalinità scinde i legami a idrogeno denaturando il DNA a singolo filamento, condizione necessaria affinché possa successivamente appaiarsi con la sonda.

5. Trasferimento (Blotting): I frammenti di DNA denaturato vengono trasferiti dal gel a una membrana solida (filtro di nitrocellulosa o nylon affine agli acidi nucleici) per capillarità. Un flusso di tampone trascina il DNA fuori dal gel contro la membrana, riproducendone l’esatta “fotocopia” e mantenendo le posizioni relative dei frammenti. La riuscita del trasferimento si verifica colorando il gel (in cui non devono più comparire bande).

   

6. Pre-ibridazione: La membrana viene posta a contatto con DNA a singolo filamento aspecifico per saturare i siti di legame liberi e prevenire l’appaiamento aspecifico della sonda.

7. Rinaturazione e Ibridazione: Si aggiunge la sonda di DNA a singolo filamento (denaturata termicamente e stabilizzata in ghiaccio). L’ibridazione richiede tempo (in genere overnight) e un graduale abbassamento della temperatura per consentire alle molecole perfettamente complementari di incontrarsi e formare legami stabili.

   • Effetto del raffreddamento brusco: Un raffreddamento improvviso in ghiaccio impedisce l’ordinato appaiamento intercatena, portando la sonda a ripiegarsi in modo disordinato su sé stessa (comportamento simile a quello dell’RNA).

8. Rilevamento: Tramite autoradiografia (per sonde radioattive) o chemiluminescenza si rivelano le bande in cui è avvenuto l’appaiamento specifico della sonda.

Applicazioni Diagnostiche e Ricerca

Sebbene oggi sia ampiamente superata dal sequenziamento genico (PCR + NGS) per via di costi e tempi, la tecnica trova o ha trovato impiego in:

• Analisi di Traslocazioni e Riarrangiamenti Cromosomici: Mutazioni che alterano i siti di restrizione o causano rimaneggiamenti strutturali determinano la comparsa di frammenti di dimensioni diverse (più lunghi o corti) rispetto al controllo sano.

  

• Diagnosi di Delezioni Geniche (es. Recettore degli Androgeni): Nei geni localizzati sul cromosoma X, un paziente maschio malato che presenta una delezione completa del gene mostrerà una totale assenza di segnale (un “buco” nel filtro di ibridazione) per tutte le bande associate a quel gene.

  

• Studio di Malattie da Espansione nucleotidica: Malattie caratterizzate dall’espansione patologica di triplette ripetute (es. da 100 a oltre 1000 ripetizioni). La Southern è preferita in questi casi complessi poiché l’elettroforesi permette di quantificare con estrema precisione le dimensioni dell’espansione, superando gli errori di scivolamento (slippage) della DNA polimerasi durante la PCR.

• Identificazione di Transgeni: Verifica dell’integrazione di DNA esogeno nel genoma di organismi geneticamente modificati.

• Medicina Legale (Friction Cases / Violenza Sessuale): Confronto del pattern dei frammenti di restrizione (fingerprinting genetico) del DNA estratto da reperti (es. sperma, tampone vaginale) con quello dei sospettati.

  

Limiti della Tecnica

• Quantità di DNA: Richiede elevate quantità di DNA genomico di partenza (a differenza della PCR che può amplificare tracce infinitesime, come un singolo capello).
• Dosaggio Genico: Non consente di discriminare con facilità variazioni del numero di copie (es. trisomie) o delezioni in eterozigosi nelle femmine per geni del cromosoma X, poiché l’allele sano maschera l’assenza del controlaterale nel segnale finale.

🔗 Collegamenti

• Ibridazione degli Acidi Nucleici — 📋 fa parte di
• Enzimi di Restrizione — ⬆ causa
• Elettroforesi su Gel — 🔗 stesso meccanismo / stessa via
• Controlli Sperimentali — 🔗 stesso meccanismo / stessa via