Centrifugazione su Gradiente di Saccarosio
La centrifugazione su gradiente di saccarosio è una tecnica di separazione che sfrutta la forza centrifuga per dividere particelle (proteine, complessi proteina-DNA, organelli) in base alle loro proprietà fisiche — principalmente dimensione, forma e massa — facendole migrare attraverso una soluzione a densità crescente.
Principio Generale
In una provetta si predispone un gradiente di saccarosio: la concentrazione di zucchero (e quindi la densità e la viscosità del mezzo) aumenta progressivamente dall’alto verso il fondo. Il campione viene depositato in un sottile strato in cima al gradiente e la provetta viene centrifugata ad alta velocità.
Sotto la forza centrifuga, ogni particella migra verso il basso a una velocità che dipende dal suo coefficiente di sedimentazione, espresso in unità Svedberg (S). Questo coefficiente non dipende solo dalla massa: due particelle di pari peso ma forma diversa sedimentano a velocità diverse.
Perché serve il gradiente (e non una soluzione uniforme): la densità e la viscosità crescenti verso il fondo stabilizzano le bande in movimento e impediscono il rimescolamento per convezione. Le particelle si separano in bande distinte lungo la provetta, ciascuna che procede alla propria velocità, invece di accumularsi tutte indistinte sul fondo. Interrompendo la corsa al momento giusto (centrifugazione zonale, basata sulla velocità) si raccolgono le frazioni separate.
Cosa permette di ricavare
- Purificazione: separa la particella di interesse dal resto dei detriti cellulari, che sedimentano a velocità diverse e finiscono in bande differenti.
- Caratterizzazione fisica: dalla posizione/velocità di sedimentazione si stimano forma, dimensioni e peso molecolare del complesso.
- Confronto tra campioni: particelle identiche sedimentano alla stessa velocità; uno spostamento di banda segnala una variazione di massa o forma.
Caso specifico: caratterizzazione del nucleosoma
Questa tecnica è stata centrale nello studio del Nucleosoma:
- I nucleosomi trattati con DNasi blanda (che taglia solo il DNA linker esposto) hanno mantenuto inalterata la velocità di sedimentazione, dimostrando che il DNA core avvolto era rimasto integro e protetto.
- Il gradiente ha permesso di purificare i nucleosomi dai detriti e di misurarne il peso molecolare reale.
- Quel peso molecolare misurato (~doppio di quello calcolato per “una copia di ciascun istone”) è il dato che, incrociato con l’SDS-PAGE a 4 bande di pari intensità, ha dimostrato la presenza di due copie per istone → l’ottamero istonico.
🔗 Collegamenti
- Nucleosoma — 🔬 tecnica usata per caratterizzarlo
- Elettroforesi su Gel — 🔄 tecnica di separazione affine (per carica/dimensione vs per sedimentazione)