Spettrofotometria

La spettrofotometria è una tecnica analitica di laboratorio che consente di stimare la concentrazione di acidi nucleici (DNA e RNA) o di altre biomolecole in una soluzione, misurando l’intensità della luce assorbita dal campione a specifiche lunghezze d’onda.

Principio di Funzionamento dello Spettrofotometro

Lo strumento misura la differenza tra la luce emessa da una sorgente e la luce trasmessa attraverso il campione per calcolare l’assorbanza (o densità ottica), che indica quantitativamente la concentrazione del soluto.

1. Alloggiamento del Campione: La soluzione purificata contenente l’acido nucleico viene posizionata in una cuvetta trasparente all’interno dello strumento.
2. Emissione Luminosa: Una sorgente emette un fascio di luce spettrale.
3. Selezione della Lunghezza d’Onda: Viene selezionata la lunghezza d’onda di 260 nm (poiché i nucleotidi degli acidi nucleici assorbono la luce ultravioletta prevalentemente a questa frequenza).
4. Attraversamento del Campione: Il fascio di luce attraversa la cuvetta.
5. Assorbimento e Rilevazione: Una frazione di energia luminosa viene assorbita dalle basi azotate, mentre la luce non assorbita (luce trasmessa) prosegue fino a colpire un rivelatore.
6. Confronto e Calcolo: Il software dello strumento confronta l’intensità della luce iniziale emessa con quella rilevata all’uscita dal campione, calcolando il valore di assorbanza.

Effetto Ipercromico e Denaturazione del DNA

L’assorbanza a 260 nm del DNA non è costante ma varia in base allo stato fisico della molecola:

• DNA a Doppia Elica (Nativo): Le basi azotate aromatiche sono impilate l’una sull’altra all’interno del nucleo idrofobico della doppia elica, risultando parzialmente schermate e limitate nella loro capacità di assorbire la luce.
• DNA a Singolo Filamento (Denaturato): Quando i due filamenti si separano (denaturazione termica o chimica), le forze di impilamento si rompono e le basi azotate si espongono completamente al solvente.
• Aumento dell’Assorbanza: A parità di concentrazione, il DNA denaturato assorbe molta più luce a 260 nm rispetto al DNA a doppio filamento. Questo fenomeno prende il nome di effetto ipercromico e viene utilizzato per monitorare la denaturazione termica e determinare la temperatura di fusione ($T_m$) del DNA.

🔗 Collegamenti

• Acidi Nucleici — 🔬 reperto diagnostico
• Struttura del DNA — 🔬 reperto diagnostico
• Elettroforesi su Gel — 🔄 diagnosi differenziale / confronto