Struttura del DNA

La struttura tridimensionale del DNA è stata risolta nel 1953 da James Watson e Francis Crick, i quali formularono il modello a doppia elica basandosi sui dati cristallografici a raggi X di Rosalind Franklin e sulle scoperte biochimiche di Erwin Chargaff.

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Le Regole di Chargaff e la Cromatografia

Erwin Chargaff fu il primo a determinare i rapporti stechiometrici delle basi azotate nel DNA utilizzando la cromatografia su strato sottile (TLC).

Principio della Cromatografia

La cromatografia consente la separazione di biomolecole sfruttando:

• Una fase stazionaria (o immobile): Una sostanza dotata di specifiche proprietà chimiche (es. carica elettrica, idrofilia, idrofobia) depositata su un supporto rigido (come una lastra di vetro nella TLC, o resine in colonna).
• Una fase mobile (solvente): Un liquido che si muove lungo la fase stazionaria per capillarità o gravità, trascinando con sé i componenti della miscela a velocità differenti a seconda della loro affinità per le due fasi.

Esecuzione della Cromatografia su Strato Sottile (TLC)

1. Chargaff isolò il DNA da vari organismi e lo sottopose a idrolisi acida per separare i singoli nucleotidi.
2. Applicò la soluzione contenente i nucleotidi su una lastrina di vetro rivestita di fase stazionaria (gel di silice).
3. Immerse la lastrina in una bacinella contenente il solvente (fase mobile).
4. Il solvente, risalendo per capillarità, trascinò i singoli nucleotidi che migrarono a distanze diverse a seconda della base azotata contenuta, formando quattro macchie distinte.
5. Utilizzando controlli positivi (nucleotidi puri con singole basi), identificò la posizione di ciascun nucleotide e calcolò la quantità di ciascuna base misurando le dimensioni e l’intensità delle macchie.

Scoperte di Chargaff

Chargaff applicò questa tecnica a DNA provenienti da diverse specie (uomo, batteri, piante, pesci), giungendo a conclusioni fondamentali:

• I quattro nucleotidi non sono presenti in quantità identiche.
• La composizione percentuale delle basi varia da specie a specie.
• La composizione del DNA umano è identica in tutti i tessuti del medesimo organismo, a testimonianza del fatto che l’informazione genetica è conservata.
• Legge di Chargaff: In qualsiasi campione di DNA a doppio filamento, la quantità di Adenina è uguale a quella di Timina ($A=T$) e la quantità di Guanina è uguale a quella di Citosina ($G=C$). Di conseguenza, il rapporto purine/pirimidine è sempre uguale a 1 ($\frac{A+G}{T+C}=1$).

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Il Modello a Doppia Elica di Watson e Crick

Il DNA si presenta fisiologicamente sotto forma di due filamenti polinucleotidici avvolti l’uno sull’altro. Questa conformazione a doppia elica rappresenta lo stato termodinamico più stabile della molecola (caratterizzato dalla minor energia libera possibile).

Caratteristiche Strutturali:

• Avvolgimento: I due filamenti si avvolgono a formare un’elica. (⚠️ Nota scientifica: Il DNA B è fisiologicamente una doppia elica destrogira. Tuttavia, a lezione è stato indicato un avvolgimento levogiro).
• Antiparallelismo: I due filamenti corrono in direzioni opposte. Un filamento presenta polarità $5^{\prime }\to 3^{\prime }$ (con l’estremità 5’-fosfato libera all’inizio e l’estremità 3’-OH libera alla fine), mentre il filamento complementare è capovolto e presenta polarità $3^{\prime }\to 5^{\prime }$.
• Appaiamento Complementare: La doppia elica è tenuta unita da legami a idrogeno che si stabiliscono internamente tra le basi azotate dei filamenti opposti. L’appaiamento è altamente specifico:
  • L’Adenina si appaia con la Timina mediante 2 legami a idrogeno ($A=T$).
  • La Guanina si appaia con la Citosina mediante 3 legami a idrogeno ($G\equiv C$).
• Diametro Costante: Poiché una purina (due anelli, ingombrante) si appaia sempre con una pirimidina (un anello, piccola), la distanza tra i due scheletri di zucchero-fosfato è costante. Il diametro dell’elica è di 2 nm (20 Å). Eventuali appaiamenti errati (mismatch) alterano localmente questo diametro creando angolature che vengono prontamente riconosciute e corrette dai sistemi di riparazione cellulari.

• Interazioni di Stabilità: Oltre ai legami idrogeno, la stabilità verticale della doppia elica è incrementata da interazioni idrofobiche deboli, come le forze di van der Waals e le forze di impilamento (stacking) delle basi azotate aromatiche l’una sull’altra.
• Forze Repulsive ed Effetto Schermo: Lo scheletro esterno formato dall’alternanza zucchero-fosfato porta cariche negative dovute ai gruppi fosfato. Tali cariche generano repulsione elettrostatica che tenderebbe a destabilizzare la doppia elica. Tuttavia, in ambiente cellulare acquoso, queste cariche negative sono schermate dagli ioni disciolti e dalle molecole d’acqua, impedendo la denaturazione spontanea del DNA. Le basi idrofobiche rimangono protette all’interno, mentre le porzioni idrofile e cariche (zuccheri e fosfati) sono esposte all’esterno a contatto con il solvente.

• Solchi del DNA: A causa della geometria dell’avvolgimento, sulla superficie esterna della doppia elica si formano due insenature di dimensioni differenti: il solco maggiore e il solco minore. Il solco maggiore ha una dimensione paragonabile a quella delle strutture ad $\alpha$-elica delle proteine; per tale motivo, le proteine regolatrici che interagiscono con sequenze specifiche di DNA (es. fattori di trascrizione) vi si legano inserendo un’elica all’interno del solco maggiore.
• Passo dell’Elica: Nella forma fisiologica prevalente (DNA B), un giro completo della doppia elica contiene circa 10.5 paia di basi.

Complementarità e Replicazione

La complementarità delle basi fornisce il meccanismo molecolare per l’ereditarietà: separando i due filamenti, ciascuno di essi può fungere da stampo per la sintesi di un filamento complementare identico a quello originario, portando alla formazione di due molecole figlie identiche alla molecola madre.

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Conformazioni Alternative del DNA

Oltre alla conformazione B descritta da Watson e Crick, il DNA può esistere in altre conformazioni geometriche a seconda del grado di idratazione e della sequenza nucleotidica:

• DNA A
• DNA Z (Queste conformazioni si riscontrano solo in particolari condizioni e non sono oggetto di trattazione dettagliata in questo corso).

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Basi Azotate Rare (Modificazioni Post-Sintetiche)

Sebbene si ritenga comunemente che il DNA contenga solo 4 basi, nei mammiferi sono presenti almeno 6 basi azotate distinte dovute a modificazioni covalenti che avvengono dopo la polimerizzazione:

• 5-metilcitosina
• 5-idrossimetilcitosina

Queste modificazioni consistono nell’aggiunta di un gruppo metilico sulla citosina ad opera di metiltransferasi. Tali basi modificate non vengono incorporate direttamente dalle DNA polimerasi (che utilizzano solo i nucleotidi canonici), ma si formano post-sinteticamente e fungono da segnali epigenetici per la regolazione e il silenziamento dell’espressione genica.

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🔗 Collegamenti

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