RFLP
Il RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, ovvero polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione) è un polimorfismo di sequenza biallelico caratterizzato dalla variazione di un singolo nucleotide che crea o elimina il sito di taglio riconosciuto da uno specifico enzima di restrizione (endonucleasi).
Un sistema RFLP è classicamente definito da tre componenti:
- Un determinato locus genico.
- Una specifica sonda di DNA.
- Uno specifico enzima di restrizione.
Metodiche di Analisi
Storicamente sono stati utilizzati due approcci principali per la determinazione genotipica degli RFLP:
1. Southern Blot (Metodo Classico)
La determinazione prevede la digestione del DNA genomico con l’enzima di restrizione, la separazione elettroforetica dei frammenti su gel, il trasferimento su membrana e l’ibridazione con una sonda complementare marcata (generalmente radioattiva).
- Allele con il sito di restrizione (presente): L’enzima taglia la sequenza nucleotidica dividendo il frammento in due sottoframmenti più corti (es. 150 bp e 350 bp). Sul gel si osserveranno due bande.
- Allele senza il sito di restrizione (assente): A causa della variazione di base, l’enzima non riconosce la sequenza e non effettua il taglio, lasciando un unico frammento integro e più pesante (es. 500 bp). Sul gel si osserverà un’unica banda.
- Eterozigote: Mostra la coesistenza di entrambi gli alleli, determinando un pattern a tre bande (due frammenti corti derivanti dall’allele tagliato e un frammento lungo derivante dall’allele integro).
WARNING
Questa tecnica classica non è più utilizzata nella routine diagnostica moderna in quanto richiede ingenti quantità di DNA genomico di partenza, l’utilizzo di isotopi radioattivi per le sonde e tempi di esecuzione estremamente lunghi.
2. PCR-RFLP
Il DNA viene amplificato tramite PCR nella regione contenente il sito di restrizione d’interesse. Successivamente, il prodotto amplificato viene incubato con l’enzima di restrizione e i frammenti digeriti vengono separati tramite una comune corsa elettroforetica su gel di agarosio. Il pattern di bande risultante (una banda per l’omozigote non tagliato, due per l’omozigote tagliato, tre per l’etereozigote) ricalca quello del Southern Blot ma con maggiore rapidità e sensibilità.
Limite Informativo
Gli RFLP sono polimorfismi biallelici (presentano esclusivamente due alleli nella popolazione). Questo comporta una bassa informatività complessiva, limitando il loro impiego nell’identificazione individuale.
Esempio (Test di Paternità): Se una madre è eterozigote per un determinato RFLP e il figlio eredita lo stesso allele materno, qualora si debba verificare la paternità tra due presunti padri omozigoti per alleli differenti, non è possibile risalire con certezza all’origine dell’allele ereditato dal figlio. Di conseguenza, gli RFLP non possiedono un potere di discriminazione sufficiente per scopi forensi o di identificazione genetica personale.
🔗 Collegamenti
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