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Genetica Forense

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Genetica Forense

La genetica forense si occupa dell’applicazione delle metodologie e delle conoscenze genetiche (tipizzazione dei polimorfismi del DNA) a fini legali, civili e penali.

Ambiti di Applicazione

  • Ambito Civile: Accertamento e disconoscimento di paternità, ricongiungimenti familiari, identificazione di vittime di disastri di massa e bambini abbandonati.
  • Ambito Penale: Identificazione del colpevole di reati violenti a partire da tracce biologiche (sangue, sperma, saliva, capelli) repertate sulla scena del crimine.
  • Ambito Clinico (Controllo del Chimerismo): Valutazione dell’attecchimento del trapianto di cellule staminali emopoietiche o midollo osseo. Poiché il ricevente diventa una chimera (coesistono le proprie cellule e quelle del donatore), la genetica forense permette di quantificare le popolazioni cellulari: l’attecchimento ideale mostra esclusivamente il profilo del donatore; la persistenza o ricomparsa del profilo del ricevente indica un rigetto o una recidiva.

Cenni Storici: Il Fingerprinting Multilocus ed il Caso Pitchfork

La genetica forense è nata negli anni ‘80 con la tecnica del DNA Fingerprinting sviluppata da Alec Jeffrey, basata sull’ibridazione multilocus di minisatelliti digeriti.

  • Il primo caso storico (1983-1986, Leicestershire): A seguito dello stupro e dell’omicidio di due ragazze, le analisi del liquido seminale dimostrarono che il colpevole condivideva lo stesso gruppo sanguigno (ABO) e lo stesso polimorfismo enzimatico PGM1 (combinazione presente nel 10% della popolazione), suggerendo un unico assassino. Un giovane affetto da deficit cognitivo confessò i delitti, ma il DNA fingerprinting dimostrò la sua totale estraneità, scagionandolo.
  • Venne condotto uno screening di massa su circa 5000 uomini locali per selezionare i soggetti con profilo ABO/PGM1 compatibile (circa 500 individui). Di questi 500 venne tipizzato il DNA fingerprint, ma nessuno risultò coincidere con le tracce biologiche.
  • Il colpevole, Colin Pitchfork, venne identificato successivamente dopo essersi vantato di aver pagato un amico affinché si sottoponesse al prelievo al suo posto. La tipizzazione del suo DNA mostrò un matching perfetto con le tracce dello stupratore.

Profilazione Moderna tramite Microsatelliti (STR)

L’analisi classica multilocus è stata sostituita dalla tipizzazione automatizzata di un pannello di microsatelliti (STR) autosomici.

I microsatelliti selezionati per uso forense devono rispettare criteri rigorosi:

  1. Elevata eterozigosità: Presenza di numerosi alleli nella popolazione.
  2. Bassa frequenza allelica: Alleli rari (collocati nelle code della distribuzione di frequenza) alzano notevolmente il potere discriminativo in caso di match.
  3. Amplificabilità ottimale via PCR: Anche a partire da reperti minimi o degradati.
  4. Risoluzione netta delle bande e tasso di mutazione ridotto.

Il Sistema CODIS

Il CODIS (Combined DNA Index System), istituito dall’FBI, definisce un pannello standardizzato di loci STR (originariamente 13 loci autosomici più il gene dell’Amelogenina per il sesso). I kit commerciali di ultima generazione analizzano contemporaneamente fino a 21 o più loci STR autosomici disposti su cromosomi differenti.

Flusso di Lavoro Tecnologico: PCR Multiplex ed Elettroforesi Capillare

La profilazione STR moderna prevede un processo automatizzato:

1. PCR Multiplex con Fluorocromi

Si esegue un’unica reazione di PCR (Multiplex PCR) contenente le coppie di primer per tutti i 21 loci da analizzare. I primer sono coniugati a sostanze fluorescenti (fluorocromi) che emettono fotoni di colori diversi (blu, verde, giallo, rosso) quando eccitati da un laser. La distinzione tra i diversi loci si basa su due parametri indipendenti:

  • Colore (Fluorocromo): Loci che presentano lo stesso peso molecolare e che si sovrapporrebbero sullo stesso canale vengono marcati con colori diversi.
  • Lunghezza (Dimensione): Loci marcati con lo stesso colore vengono progettati per produrre frammenti di dimensioni differenti, garantendo che migrino in zone distinte.

2. Elettroforesi Capillare

I campioni denaturati a singolo filamento vengono immessi in un sequenziatore automatico dotato di un sottile capillare contenente un polimero denso. Sotto l’azione di un forte campo elettrico, i frammenti migrano verso il polo positivo a velocità inversamente proporzionale alla loro lunghezza. Un laser posizionato alla fine del capillare eccita i fluorocromi e la luce emessa viene registrata da un rilevatore ottico.

3. Analisi del Software

  • Genescan: Elabora i segnali di fluorescenza ricostruendo un elettroferogramma, in cui ciascun picco rappresenta un allele. La posizione del picco lungo l’asse delle ascisse corrisponde al peso molecolare preciso del frammento.
  • Genotyper: Associa ciascun picco al rispettivo locus genico e assegna il genotipo corretto (il numero di ripetizioni dell’allele) confrontando i pesi molecolari dei picchi con un riferimento standard noto come allelic ladder (una miscela contenente tutti gli alleli noti per ciascun locus).

Determinazione del Sesso (Amelogenina)

Il gene dell’Amelogenina (AMELX sul cromosoma X e AMELY sul cromosoma Y) presenta un polimorfismo di lunghezza tra i due cromosomi sessuali: la variante situata sul cromosoma X è lunga 106 bp, mentre quella sul cromosoma Y è lunga 112 bp.

  • Femmina (XX): Mostra un singolo picco omozigote da 106 bp.
  • Maschio (XY): Mostra due picchi eterozigoti (uno da 106 bp e uno da 112 bp).

Il locus del gene AMELY rappresenta uno dei marcatori impiegati all’interno dei pannelli standardizzati del sistema CODIS per l’identificazione forense del sesso biologico di un individuo.

(Integrazione da: sbobina 26)

Interpretazione dei Risultati: Esclusione e Regola del Prodotto

I risultati di un confronto genetico si dividono in due esiti fondamentali:

1. Risultato di Esclusione

Il profilo genetico del sospettato (o del presunto padre) differisce da quello della traccia biologica (o del figlio) anche per un solo locus genico (escluso il raro caso di mutazione germinale de novo). L’individuo viene escluso categoricamente in quanto è impossibile che sia l’origine della traccia.

2. Risultato di Non Esclusione (Match)

Il profilo genetico del sospettato coincide perfettamente con quello della traccia (o mostra compatibilità genitore-figlio) per tutti i loci analizzati.

Per stimare il valore probatorio del matching si utilizza la regola del prodotto:

  • Si determina la frequenza genotipica di ciascun locus nella popolazione di riferimento (per un locus eterozigote la frequenza è , per un omozigote è , dove e sono le frequenze alleliche in popolazione).
  • Si moltiplicano le frequenze genotipiche di tutti i loci analizzati (sotto l’assunto di indipendenza statistica tra loci situati su cromosomi diversi).
  • Il valore risultante rappresenta la probabilità che un individuo preso a caso nella popolazione condivida per puro caso lo stesso identico profilo genetico multilocus. Con 21 loci analizzati, tale probabilità è infinitesima (es. 1 su centinaia di miliardi), garantendo un’identificazione pressoché assoluta.

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