Sequenziamento Gerarchico
Il sequenziamento gerarchico (noto anche come approccio clone-by-clone o mappa-prima-sequenzia-dopo) è la metodologia di sequenziamento genomico adottata dal consorzio pubblico del Progetto Genoma Umano (HGP). Pur essendo più lento rispetto a metodiche concorrenti, garantisce un’elevata precisione e consente la ricostruzione di porzioni di sequenza molto lunghe.
Fasi del Processo
1. Generazione di una Libreria di DNA Overlappante
Si parte dal genoma completo di un individuo, il quale viene frammentato utilizzando gli enzimi di restrizione.
- Per ottenere frammenti parzialmente sovrapponibili (overlappanti), si esegue una digestione enzimatica parziale: la reazione di taglio viene bloccata rapidamente. In questo modo l’enzima non ha il tempo di tagliare tutti i siti di restrizione presenti, generando frammenti di dimensioni variabili che conservano sovrapposizioni alle estremità (es. in figura, diversi frammenti contengono porzioni comuni).
2. Costruzione della Mappa Fisica
Una volta generata la libreria di frammenti sovrapponibili, si costruisce una mappa fisica ad alta risoluzione del cromosoma o della regione genomica d’interesse. Questo passaggio permette di definire la posizione originaria e reciproca di ciascun frammento lungo il cromosoma prima di procedere alla lettura.
3. Clonazione e Sequenziamento
I singoli frammenti mappati vengono clonati all’interno di vettori (es. BAC o YAC) per essere amplificati e successivamente sequenziati singolarmente.
4. Assemblaggio dei Contig
I dati di sequenza ottenuti vengono allineati computazionalmente identificando le regioni terminali sovrapponibili. La disposizione ordinata e contigua di questi frammenti sovrapposti permette di definire i contig (sequenze contigue) e di ricostruire l’esatta sequenza dell’intera regione genomica di partenza.
🔗 Collegamenti
- Progetto Genoma Umano — ⬆️ causa
- Sequenziamento Shotgun — 🔄 diagnosi differenziale / confronto