CISH e SISH

La FISH è stata la tecnica gold standard per le indagini citogenetiche in situ, ma richiede un microscopio a fluorescenza molto costoso (8–10 volte più di un microscopio ottico, fino a 100–150.000 €) e un certo expertise, oltre a una competenza citogenetica per la sua gestione. Per questo in molti ospedali e laboratori è sostituita da tecniche di ibridazione in situ in campo chiaro (brightfield in situ hybridization), leggibili con un normale microscopio ottico e con le stesse modalità interpretative: anch’esse si basano sull’identificazione del segnale gene-specifico, di cui si rileva l’aumento.

• CISH (chromogenic in situ hybridization) — i risultati si visualizzano con i cromogeni usati in Immunoistochimica (DAB) e un microscopio ottico.
• SISH (silver in situ hybridization) — usa la precipitazione con sali d’argento per evidenziare dove la sonda si è legata.

Esistono anche CISH “dual color” con un sistema gene-specifico di un colore e uno centromero-specifico di un altro, spesso applicati su due sezioni successive relative alla stessa area tissutale (es. la stessa area tumorale): in una si contano i segnali del gene, nell’altra quelli del centromero, valutando gli stessi nuclei ed evitando l’eccessiva sovrapposizione. Il ricorso a immunoreazioni in sezioni consecutive è frequente proprio perché la tecnica a doppio colore è indaginosa e richiede una messa a punto ottimale: virtualmente si contano nelle stesse cellule il segnale dell’uno e dell’altro e se ne calcola il rapporto.

Da quando si è scoperto che l’amplificazione coincide con la comparsa di cluster di amplificazione, anche le tecniche in campo chiaro si sono semplificate: è sufficiente identificare i cluster del segnale di HER2 a livello nucleare per definire la presenza di amplificazione.

Marcatura della sonda con DNP

Nell’ibridazione in campo chiaro la sonda gene-specifica non è marcata con un fluorocromo, ma è legata covalentemente a una sostanza, di solito il DNP (dinitrofenolo). Si aggiungono poi un anticorpo primario anti-DNP e un sistema secondario che evidenzia l’avvenuta reazione antigene-anticorpo. Modificando enzimi e cromogeni si ottengono colori diversi.

Vedere colori diversi nella medesima sezione non è però semplice, perché in parte i segnali si sovrappongono: da qui il ricorso frequente a sezioni consecutive.

Metallografia enzimatica

È un’altra tecnica di ibridazione in situ in campo chiaro, molto utilizzata perché particolarmente efficace. Anche in questo caso la sonda è marcata con DNP, seguita da anticorpo primario anti-DNP e anticorpo secondario.

La differenza sta nella rivelazione: la molecola enzimatica (sempre perossidasi di rafano) non viene cimentata con una reazione cromogenica, ma con una soluzione di argento ionico che, per effetto della reazione enzimatica, viene ridotta ad argento metallico insolubile che precipita. Il risultato sono segnali neri, quasi indistinguibili tra loro: per i due segnali — gene-specifico e centromerico — è quindi necessario usare sezioni diverse.

(Sezione espansa con: sbobina 9)

🔗 Collegamenti

• FISH — 🔄 alternativa in campo chiaro alla fluorescenza
• Immunoistochimica — 🔗 condivide i cromogeni (DAB)
• Score Immunoistochimico di HER2 (Criteri ASCO-CAP 2018) — 🔗 contesto clinico in cui si cerca l’amplificazione