FISH

La FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) è una tecnica che identifica eventi citogenetici (presenza, numero o posizione di un gene) tramite ibridazione. Il nome ne descrive i tre cardini:

• Ibridazione — legame tra il DNA (o RNA) del campione e una sonda (probe) di DNA complementare;
• Fluorescente — la sonda è coniugata a un fluorocromo;
• In situ — eseguita direttamente sulla sezione istologica o sul preparato citologico a vetrino.

Le sonde marcate si legano a un gene o cromosoma specifico; il risultato si valuta al microscopio a fluorescenza (lampada a vapori di mercurio, raggi UV). I fluorocromi riemettono luce a lunghezza d’onda maggiore (energia minore) di quella che li ha colpiti; lo spettro del visibile va ~480–760 nm. La scelta del fluorocromo (con i suoi spettri di assorbimento/emissione) è fondamentale.

Metodica

1. Preparazione — materiale fissato in formalina e incluso in paraffina (o fissazione alcolica). I tempi sono critici: una Fissazione eccessiva crea legami crociati che impediscono alla sonda di raggiungere il DNA; ottimale 12–24 h, oltre le 72 h rovina il campione. La fissazione alcolica è rapida (denatura le proteine per precipitazione, senza legami crociati) ma poco adatta a campioni molto ricchi di proteine. ⚠️ La decalcificazione con acidi forti (nitrico, solforico) impedisce l’ibridazione: su biopsie ossee servono decalcificanti non acidi (resine a scambio ionico), altrimenti si perde la FISH (es. diagnosi differenziale dei carcinomi mammari su metastasi ossee).
2. Denaturazione (codenaturazione) — eliminata la paraffina (scale di alcol/xilolo), si pretratta il campione con calore ed enzimi per rimuovere i reticolati della formalina e il guscio proteico degli istoni, aprendo il DNA. L’ibridazione avviene solo sul DNA a singola elica: il processo è rapidissimo e transiente, quindi denaturazione di campione e sonda devono avvenire contemporaneamente (codenaturazione).
3. Ibridazione — sonda e DNA bersaglio a contatto; oggi bastano 2–3 h (un tempo serviva l’incubazione over-night).
4. Lavaggi post-ibridazione (stringenza) — rimuovono il legame aspecifico DNA-sonda/DNA-ospite (eccesso di sonda) per aumentare la specificità del segnale. Aumentano la stringenza: alta temperatura (toglie legami H) e bassa concentrazione salina del tampone (2×SSC → 0,5×SSC).
5. Controcolorazione con DAPI — per vedere il nucleo in campo scuro (appare come una masserella blu tenue) e localizzare l’ibridazione. Si usa ematossilina molto diluita (Harris o Meyer) e il colorante specifico DAPI.

Applicazioni

• Amplificazioni / “polisomie” geniche — es. HER-2, EGFR.
• Traslocazioni geniche — malattie linfoproliferative, sarcomi.

Amplificazione di HER-2 nel carcinoma mammario

La FISH è stata a lungo il gold standard. Una sonda per HER-2 (braccio lungo del cromosoma 17) si ibrida col DNA e conta le copie del gene per nucleo in interfase (si analizzano 60–100 nuclei interfasici; attenzione a non sovrapporre i nuclei). Una cellula normale ha al massimo 4 copie; scopo è capire quando n > 4.

Per distinguere amplificazione da semplice duplicazione si marca anche il centromero: due sonde (rosso = gene HER-2, verde = centromero del cromosoma 17). Si calcola il rapporto rosso/verde:

• da 1 a 2 → normalità;
• R > 2 (per convenzione 2,2) → amplificazione;
• valori intorno a 2 → aumentare il numero di nuclei analizzati.

Nei quadri: normalità (2 rossi : 2 verdi); amplificazione (cluster di tantissimi segnali rossi indistinguibili, 2 verdi); polisomia (aumento sia dei verdi sia dei rossi). Polisomia e amplificazione possono coesistere (cluster rossi + aumento dei verdi). In realtà non esiste una vera polisomia del cromosoma 17: si tratta di amplificazione della regione centromerica, impropriamente chiamata polisomia.

La risposta a Herceptin si associa più all’amplificazione del gene che all’iperespressione della proteina: nel 97% dei casi le due coincidono, nel 3% no. Per questo, davanti a un’Immunoistochimica dubbia per HER-2, si verifica l’amplificazione con FISH. L’IIC identifica la proteina, la FISH l’amplificazione. Spessore ottimale della sezione: 2–3 µm (troppo spessa → sovrapposizioni; troppo sottile → perdita di segnale).

---

(Integrazione da: sbobina 9)

Molto spesso i segnali rossi corrispondenti al gene HER-2 sono così numerosi da non poter essere contati nel dettaglio: si valutano allora come raggruppamenti, e si parla di cluster quando in un raggruppamento vi siano almeno 6 segnali. La sola presenza di cluster definisce la presenza di amplificazione.

Traslocazioni nelle malattie linfoproliferative

Su piastre metafasiche (cellule trattate con soluzioni ipotoniche):

• Ciclina D1 — la traslocazione ne aumenta la trascrizione; agisce come fattore nucleare attivando la proliferazione → linfoma mantellare.
• BCL2 — la traslocazione lo porta vicino al locus delle catene pesanti delle immunoglobuline (costituzionalmente attivo); BCL2 (antiapoptotico) viene iperespresso → linfoma follicolare. Utile per distinguere iperplasia follicolare da linfoma follicolare (il centro germinativo normale non esprime BCL2).

Con sonda dual-color (es. ciclina D1 verde + catene pesanti rosse): la normalità dà due rossi e due verdi; se i segnali si sovrappongono si vede un segnale giallo → traslocazione avvenuta.

Traslocazioni nei sarcomi dei tessuti molli

Si usano sonde break-apart (“taglia e separa”): la medesima sonda porta due fluorocromi di colore diverso su parti diverse del gene, costruita su porzioni non coinvolte dalla rottura. Gene integro → segnale giallo (sovrapposizione); traslocazione → rosso e verde separati (segnali di split). Utile quando si conosce il gene ma non il pattern di traslocazione, o quando i pattern sono molti. Esempio: sarcoma sinoviale (gene SYT/SS18, braccio lungo del cromosoma 18 → braccio corto del cromosoma X).

Problemi tecnici

• Bassa amplificazione (es. nel CRC).
• Falsi negativi: fissativo inadatto (Bouin) o decalcificazione; eccessiva fissazione (aumentare il pretrattamento); alta stringenza (ridurre i lavaggi); spessore troppo piccolo (si perde il segnale del cromosoma non compreso nella sezione).
• Falsi positivi: bassa stringenza (aumentare i lavaggi); sovrapposizione dei segnali per eccessivo spessore.
• Interpretazione: amplificazione vs polisomia.

🔗 Collegamenti

• Immunoistochimica — 🔄 IIC vede la proteina, FISH l’amplificazione genica
• CISH e SISH — 🔄 ibridazione in situ in campo chiaro (alternative)
• Fissazione — ⬆️ i tempi di fissazione condizionano l’ibridazione
• EGFR — 🔗 bersaglio molecolare studiabile anche in FISH
• Patologia Terapeutica — 🔗 strumento predittivo
• Sarcoma Sinoviale — 🔬 t(X;18) documentata con sonda break-apart
• Classificazione Istologica dei Tumori dei Tessuti Molli (Morfologia, IHC, Molecolare) — 🔗 le traslocazioni caratterizzano i tumori dei tessuti molli