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Analisi Mutazionale

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Analisi Mutazionale

L’analisi mutazionale ricerca alterazioni di sequenza del DNA con finalità prevalentemente predittive (vedi Patologia Terapeutica), come per le mutazioni di EGFR nell’adenocarcinoma polmonare.

Metodiche

  • Sequenziamento diretto — metodica di scelta, perché legge la sequenza effettiva ed evita di “mancare” mutazioni inattese.
  • Real-time PCR — sistemi quantitativi che in tempi rapidi (30–60 minuti) rilevano le mutazioni per cui il test è costruito (in base ai primer). Più sensibile del sequenziamento diretto.

⚠️ Una mutazione inaspettata non prevista dai primer dà un falso negativo: per questo si preferisce spesso il sequenziamento diretto. I kit commerciali recenti, con molte combinazioni, riducono il rischio.

Cause di falso negativo

  • Commistione di cellule normali e neoplastiche → il DNA mutato viene diluito in quello normale (es. 100 cellule neoplastiche in 100.000 normali); serve una microdissezione per arricchire il campione di cellule neoplastiche.
  • Campioni molto piccoli (adeguatezza delle biopsie).
  • Variabilità delle polimerasi (errore di sintesi dell’amplificato).
  • Tipo di analisi → ogni tecnica ha un limite di sensibilità intrinseco; il test va scelto in funzione del numero di cellule neoplastiche nel campione. Un laboratorio deve disporre di più tecnologie per lo stesso risultato.

In una logica di medicina personalizzata un falso negativo equivale a privare il paziente di un trattamento efficace ed è equiparato all’errore diagnostico.

(Integrazione da: AP 1 bis - Generalità)

PCR e NGS: due grandi categorie

In Biopsia Liquida (e più in generale) le componenti molecolari si identificano con due famiglie di metodiche:

  1. Metodi basati sulla PCR — qPCR/PCR Real-Time (quantitativa), ddPCR (digital-droplet PCR, ancora più sensibile) e beaming (palline magnetiche per isolamento e amplificazione). Sono tecniche a bersaglio: occorre conoscere a priori l’alterazione cercata, quindi si trovano solo alterazioni precodificate nel saggio. Vantaggi: elevata sensibilità (soprattutto ddPCR e beaming), tempi brevi (poche ore, primer specifici) e bassi costi. Svantaggio: si trova solo ciò che è già codificato.
  2. Next Generation Sequencing (NGS) — pensata per ampi pannelli di geni (fino a esoma/genoma intero); identifica mutazioni, copy number variations (amplificazioni/delezioni) e geni di fusione. È quantitativa: stima anche la proporzione dell’evento rispetto al DNA allelico (più alta la percentuale di DNA mutato, maggiore l’efficacia attesa del farmaco). Svantaggi: costi gestionali più alti, tempi più lunghi (≥2–3 giorni) e maggiore rischio di falsi positivi (amplificazioni massive → errori di replicazione della polimerasi), evento invece raro nella PCR semplice a bersaglio.

Sensibilità vs specificità

Entrambe le famiglie hanno specificità molto alta (spesso fino al 100%) ma sensibilità più bassa (~50–80%, in genere 60–70%). Quindi in 1/3–1/2 dei casi si ottiene un risultato negativo (falso negativo) che non esclude la mutazione.

  • ➔ Di fronte a una negatività in biopsia liquida, le linee guida impongono una verifica tissutale (vedi Applicazioni Cliniche della Biopsia Liquida).
  • Il falso positivo è poco rilevante, con opportuni controlli e tecnologie sofisticate (molte certificate CIVD, sistemi chiusi e controllati).

Data la bassa sensibilità, spesso è necessario usare più metodiche.

(Sezione integrata con: AP 1 bis - Generalità)

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