Acidi Nucleici Liberi Circolanti

Gli acidi nucleici liberi o “cell-free” sono uno dei bersagli della Biopsia Liquida, indipendenti dalle Cellule Tumorali Circolanti. Nella maggior parte dei casi si ricerca il cf-DNA (il DNA è il più indagato), ma si possono cercare anche cf-RNA e cf-micro-RNA. Quando di derivazione tumorale si parla anche di ctDNA / ct-nucleic acids (circulating tumor DNA/nucleic acids).

cf-DNA

Il DNA libero deriva dalla necrosi o apoptosi delle cellule tumorali, oppure dalla rottura delle stesse cellule tumorali circolanti. Può essere completamente libero (flottante nel plasma) o contenuto negli esosomi (vedi Esosomi), perché esiste una secrezione attiva: i tumori trasmettono attraverso esosomi particelle rivestite di membrana, non solo come prodotto del disfacimento cellulare. Si possono trovare anche frammenti digeriti dai macrofagi.

Genometastasi: la capacità di acidi nucleici mutati con potere trasformante di essere fagocitati da cellule normali a distanza, esponendole alla trasformazione neoplastica. La metastasi non è quindi legata solo alla propagazione della cellula intera, ma anche dell’acido nucleico mutato — fenomeno analogo alla trasformazione genica batterica (scambio di materiale genetico, es. resistenza agli antibiotici).

Il cf-DNA si presenta in unità corte (mediamente 146 bp), simili ai filamenti che costituiscono i nucleosomi (unità di ultra-impacchettamento del DNA su cui agisce la regolazione della cromatina). Non è quindi frammentato “a casaccio”, ma prodotto ed elaborato in modo sofisticato, capace di regolare espressione genica, differenziazione e attività replicativa — con conseguenze importanti soprattutto in termini di genometastasi.

Sistemi untargeted (non a bersaglio) per identificarlo: Next Generation Sequencing (DNA totale o solo esoni), cariotipizzazione digitale (acquisizioni/delezioni di tratti cromosomici), studio della metilazione (geni silenziati per metilazione del promotore). Si usano anche metodiche di tipo PCR (a bersaglio) per singole alterazioni o pannelli di geni precodificati, come gli hot spots (regioni ripetutamente modificate). Esempi tecnologici: digital droplet PCR, beaming, CAPP-Seq, TAM-Seq.

cf-RNA e mi-RNA

Il cf-RNA è meno stabile: nel sangue sono presenti molte RNasi che degradano soprattutto gli mRNA, rendendo difficili risultati ripetibili sugli mRNA liberi.

I cf-mi-RNA danno risultati più consistenti: il micro-RNA fuori dagli esosomi resiste molto di più alle RNasi ed è facilmente identificabile (qRT-PCR, microarray, deep sequencing). Essendo i micro-RNA noti circa 400, esistono card in qRT-PCR che li analizzano tutti, ottenendo un profilo dei micro-RNA derivati dal tumore. Questo permette di seguire la risposta alla chemioterapia o la ripresa di malattia, spesso anticipandola di settimane/mesi, o — applicato allo screening con TC spirale a basso dosaggio — di anticipare l’identificabilità del tumore all’imaging.

Limite: distinguere tumorale da normale

La maggior parte degli acidi nucleici circolanti (sia cf-DNA che mRNA/mi-RNA) deriva da cellule normali, ed è presente anche in condizioni di normalità (aumenta anche nelle malattie infiammatorie croniche). Distinguere la quota tumorale è difficile. Per il cf-DNA è più semplice: il DNA normale è più lungo, mentre il DNA tumorale realizza unità di 146 bp; con NGS si possono scorporare i frammenti per lunghezza e selezionare quelli più corti, verosimilmente tumorali.

🔗 Collegamenti

• Biopsia Liquida — 📋 bersaglio della biopsia liquida
• Esosomi — 🔗 veicolo degli acidi nucleici (secrezione attiva)
• Cellule Tumorali Circolanti — 🔄 bersaglio alternativo
• Analisi Mutazionale — 🔬 metodiche di identificazione (PCR, NGS)
• EGFR — 🔬 cf-DNA è l’unico materiale ammesso per il testing in biopsia liquida