Citofluorimetria a Flusso

La citofluorimetria a flusso è una tecnica strumentale per la misura simultanea di più caratteristiche fisiche e/o chimiche di singole cellule che scorrono in un flusso laminare. Dà informazioni su struttura, vitalità cellulare e diversi costituenti.

Componenti del citofluorimetro

• Sistema fluidico — trasporta le particelle nella zona di misura.
• Sistema ottico-elettronico — ottiene più misure per singola particella.
• Apparato elettronico — digitalizza le misure e le rappresenta come istogrammi (ascissa: intensità di fluorescenza; ordinata: numero di eventi) e dot-plot bidimensionali (correlano due parametri).

Il sistema microfluidico isola le cellule l’una dall’altra. La tecnica è ben applicabile a preparati citologici già disgregati (sangue, midollo osseo); su cellule aggregate serve una separazione meccanica (forbici) ed enzimatica (tripsina). Le cellule, marcate, attraversano un fascio laser generando segnali fisici o di fluorescenza.

Parametri fisici (scatter)

• SSC (side scatter, deviazione a 90°/ampio angolo) → complessità cellulare.
• FSC (forward scatter, deviazione in avanti/piccolo angolo) → dimensione cellulare.

In base a come il laser viene rimbalzato o deviato si identificano cellule diverse e se ne discrimina la dimensione.

Parametri biologici (fluorescenza)

Legati ai fluorocromi (emettono a lunghezza d’onda minore), letti da detettori ad altissima velocità (fino a 10.000 cellule/secondo). Permettono di valutare: vitalità e apoptosi (coloranti vitali), contenuto di DNA (ioduro di propidio), fasi del ciclo cellulare e ploidia, antigeni di membrana, proteine citoplasmatiche e nucleari.

Esempi applicativi

• Citogramma (ascissa SSC, ordinata FSC): nuvole in posizioni diverse = popolazioni cellulari diverse. Aggiungendo anticorpi si identificano sottopopolazioni: es. linfociti B CD19+; con CD5 si separano le cellule CD19+/CD5− dalle CD19+/CD5+, queste ultime tipiche della leucemia linfatica cronica (CLL).

• Analisi del ciclo cellulare con ioduro di propidio: la diversa quantità di DNA permette di separare le fasi del ciclo e di riconoscere cellule diploidi, aneuploidi, tetraploidi, in condizioni normali e patologiche.

• Cell sorting — separa popolazioni cellulari (es. tramite anticorpi specifici), più in ricerca che in clinica. Un trasduttore piezoelettrico rompe il flusso in goccioline (una cellula per goccia); applicando un voltaggio le gocce si caricano positivamente o negativamente e, attraversando placche ad alto voltaggio, vengono deflesse e raccolte in provette. Le cellule separate restano vitali e si usano per clonaggi, studi funzionali, estrazione di acidi nucleici e proteine; i cromosomi per bandeggi, sequenze, FISH.

🔗 Collegamenti

• Esame Citologico — 🔗 ideale su preparati citologici già disgregati
• Immunoistochimica — 🔄 anch’essa usa anticorpi/fluorocromi per identificare antigeni
• FISH — 🔗 i cromosomi separati possono essere usati per FISH