Proteine Ricombinanti

Le proteine ricombinanti sono la prima classe di Farmaci Biologici, proteine umane prodotte da cellule ingegnerizzate grazie alle tecniche di biologia molecolare (sviluppate a partire da metà anni ‘70 / inizio anni ‘80).

Strumenti molecolari di base

• Enzimi di restrizione: scoperti studiando i batteri che si difendono dai batteriofagi. Quando il fago inietta il proprio DNA, l’enzima lo digerisce; il DNA batterico, non compartimentalizzato in un nucleo, è protetto. Ogni enzima riconosce e taglia una specifica sequenza di DNA. Ne esistono decine, il che permette di tagliare il DNA in punti precisi (a differenza della rottura casuale meccanica, che produce uno smear).
• Ligasi T4 (anch’essa di origine fagica): permette di ricucire un frammento di DNA in un plasmide, usato poi per amplificarlo.

Perché non basta clonare il gene

Inserire direttamente un gene umano in un plasmide batterico non funziona: i geni sono molto grandi e contengono introni, mentre i batteri non hanno introni e non fanno splicing. Serviva accedere alla sola sequenza codificante.

La trascrittasi inversa e il cDNA

La soluzione è arrivata dallo studio dei retrovirus (virus a RNA che parassitano un mondo a DNA): la trascrittasi inversa trascrive l’RNA in DNA. Si purifica quindi direttamente l’mRNA della proteina desiderata e lo si retrotrascrive in cDNA (“c” = copia), privo di introni. Si ottiene un doppio filamento (uno identico all’mRNA, l’altro complementare), che con gli enzimi di restrizione viene tagliato e inserito in un plasmide.

(La stessa trascrittasi inversa è bersaglio dei primi farmaci antiretrovirali contro l’HIV.)

Scelta della cellula produttrice

Il plasmide può essere introdotto in batteri, lieviti o cellule di mammifero. La scelta dipende dalle modificazioni post-traduzionali richieste (alcune, come glicosilazione e folding, possono essere co-traduzionali):

• i batteri non le eseguono;
• i lieviti le eseguono con minore precisione;
• le cellule di mammifero riproducono fedelmente glicosilazioni simili alla proteina nativa, ma comportano il rischio di virus pericolosi per l’uomo.

Esempi (replacement therapy)

Le proteine ricombinanti nascono come terapie di rimpiazzo:

• Ormone della crescita (GH): prima si estraeva dall’adenoipofisi di cadaveri, con rischio di infezione da virus lenti e gravi limiti di quantità.
• Insulina: tra le prime; in precedenza ricavata dal maiale, con problemi anche di natura religiosa.
• Fattore VIII (emofilia A): prima si usavano i plasmaderivati, che però negli anni ‘80 hanno contaminato con HIV quasi il 100% degli emofilici (il virus non era ancora noto né ricercato — “si trova solo quello che si cerca”). Il fattore VIII ricombinante ha trasformato la sicurezza di questi pazienti.
• tPA (Tissue Plasminogen Activator): non è terapia sostitutiva; degrada la fibrina e si usa per sciogliere il trombo (es. nell’infarto miocardico). Primo prodotto da Genentech.

🔗 Collegamenti

• Farmaci Biologici — 📋 classe di appartenenza
• Allungamento dell’Emivita delle Proteine Ricombinanti — ➡️ evoluzione (proteine a emivita modificata)
• Anticorpi Monoclonali — 🔗 stessa tecnologia DNA ricombinante