Studi di Legame e Costante di Dissociazione (Kd)

L’interazione tra farmaco e recettore si studia su due livelli. Gli studi di legame (primo livello) analizzano l’interazione molecolare e forniscono parametri biochimico-farmacologici come l’affinità e le informazioni sulle isoforme presenti in un tessuto, ma non dicono cosa fa il farmaco sul recettore (se lo attiva o lo blocca): per quello servono gli studi funzionali (curve dose-risposta). Nello sviluppo di un farmaco si fa prima uno screening per affinità, scartando le molecole che non legano il bersaglio.

Equilibrio: kon e koff

Il complesso farmaco-recettore [RX] è ciò che produce la risposta biologica. La sua formazione è regolata da due costanti:

• kon — quanto il ligando è propenso a legarsi al recettore;
• koff — quanto è propenso a staccarsi.

All’equilibrio la velocità di associazione eguaglia quella di dissociazione (Von = Voff), con Von = kon·[R]·[X] e Voff = koff·[RX] (dove [R] = recettore libero, [X] = ligando, [RX] = complesso).

Costante di dissociazione (Kd)

Kd = ([R]·[X]) / [RX] è la costante di dissociazione, indice dell’affinità del farmaco per il suo bersaglio (recettore, pompa, canale). Vale la regola: Kd bassa = affinità alta (rapporto sbilanciato a favore del complesso [RX]). Tra due farmaci sullo stesso recettore, quello con Kd più bassa è il più affine. L’affinità è imparentata con la potenza del farmaco.

Teoria dell’occupazione

Dietro l’azione di un farmaco c’è la teoria dell’occupazione: più recettori sono occupati, maggiore è la risposta biologica (conseguenza della legge d’azione delle masse). La quota di recettori occupati dipende dal numero totale di recettori, soprattutto dalla concentrazione del ligando, e dall’affinità di legame/dissociazione (diversa per ogni coppia farmaco-recettore).

Quantificazione: isoterma di Hill-Langmuir

Poiché i recettori totali sono Rt = [R] + [RX], con i passaggi si ricava il recettore legato:

B = (Bmax·[X]) / (Kd + [X])

Misurando sperimentalmente la quantità legata in funzione della concentrazione del ligando si derivano sempre Bmax (massimo legame possibile nel tessuto) e Kd.

Nel grafico dell’isoterma di Hill-Langmuir (asse x = concentrazione del ligando; asse y = recettore legato) la curva sale fino al plateau, raggiunto quando tutti i recettori sono saturi. In forma semi-logaritmica (logaritmo della concentrazione sull’asse x) la curva diventa sigmoide: graficamente la Kd è la concentrazione di farmaco che occupa il 50% dei recettori, e ha le dimensioni di una concentrazione.

Come si fa in pratica: i radioligandi

Un saggio di legame ha bisogno di un ligando marcato (con ³H o ¹²⁵I) e di un requisito non ovvio: il ligando deve restare attaccato durante i lavaggi che separano il legato dal libero. Un ligando che si stacca in fretta viene perso nel lavaggio e il risultato è falsamente basso. Per questo i radioligandi storici sono molecole ad affinità altissima e dissociazione lenta.

Radioligando	Bersaglio	Perché è stato scelto
¹²⁵I-α-bungarotossina (α-Bungarotossina)	recettore nicotinico Nm, vedi Recettore Colinergico Nicotinico della Placca Neuromuscolare	Kd picomolare e dissociazione lentissima → permise di isolare e contare per la prima volta un recettore di membrana (organo elettrico di Torpedo, anni ‘70). È il caso fondativo di questa metodica
³H-flunitrazepam	sito benzodiazepinico del Recettore GABA-A	mappò la distribuzione regionale delle subunità e la loro diversa affinità per le Benzodiazepine
³H-spiperone, ³H-raclopride	recettori D2, vedi Recettori della Dopamina	usati per correlare l’occupazione recettoriale all’effetto clinico degli antipsicotici: si scoprì così che l’effetto compare intorno al 65-70% di occupazione D2 e gli extrapiramidali sopra l’80%
³H-diidroalprenololo	recettori β-adrenergici	dimostrò la downregulation dei β2 da agonismo cronico (vedi Desensibilizzazione e Downregulation Recettoriale)

Il limite da tenere a mente. Nessuno di questi esperimenti dice cosa fa il farmaco. Un agonista pieno, un agonista parziale, un antagonista e un agonista inverso con la stessa Kd danno curve di legame identiche e risposte biologiche opposte. Per distinguerli serve il passaggio successivo, le curve dose-risposta. Lo stesso vale per la tubocurarina e la succinilcolina: legano lo stesso sito dello stesso recettore, e fanno cose opposte.

🔗 Collegamenti

• Recettore (Definizione Farmacologica) — ⬆️ presuppone il legame farmaco-recettore
• Curve Dose-Risposta - Efficacia e Potenza — ➡️ secondo livello di studio (funzionale)
• Agonista e Antagonista — 🔗 l’occupazione recettoriale ne governa l’azione
• Legge di Azione delle Masse — ⬆️ il principio da cui deriva tutta la formalizzazione
• α-Bungarotossina — 🔬 il radioligando che fondò la metodica
• Patch Clamp — 🔬 l’altra tecnica di studio, sul versante funzionale