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Terapia Genica

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Terapia Genica

La terapia genica consiste nell’inserzione, manipolazione o modifica di materiale genetico all’interno di una cellula ospite allo scopo di trattare o prevenire una patologia. Si applica prevalentemente a malattie monogeniche dovute a mutazioni con perdita di funzione (loss-of-function), ma trova impiego anche nel trattamento di neoplasie e malattie infettive (es. infezione da HIV).

Storia ed Evoluzione Clinica

La storia della terapia genica è caratterizzata da fasi alterne di entusiasmo e arresti drammatici dovuti a complicanze immunologiche ed inserzionali:

  • 1972: Formulazione dei primi concetti teorici relativi all’inserimento di geni per curare malattie umane.
  • Anni ‘90: Primo trattamento clinico di un paziente affetto da ADA-SCID (immunodeficienza combinata grave da deficit di adenosina deaminasi) mediante inserimento ex vivo del gene ADA sano. L’efficacia del trial risultò in parte ambigua poiché associata alla concomitante somministrazione della proteina ricombinante.
  • Anni 2000: Avvio di trial clinici per la malattia di Parkinson, per la Beta-Talassemia e per l’infezione da HIV (2014).
  • Incidenti storici: Decesso di una paziente trattata con vettori adenovirali sistemici a causa di una massiva e incontrollata risposta immunitaria contro il capside virale.
  • Sviluppi moderni: Introduzione delle cellule CAR-T per il trattamento di linfomi ematologici (linfociti T autologhi prelevati, ingegnerizzati ex vivo per esprimere recettori chimerici e rifusi nel paziente) e successo di protocolli locali per malattie oculari (es. retinite pigmentosa). Sono in fase avanzata trial clinici con vettori virali per l’emofilia e per la Beta-Talassemia.

Terapia Genica Somatica vs Germinale

  • Terapia genica somatica: La modifica genetica è limitata esclusivamente alle cellule somatiche del paziente (es. cellule del sangue, dell’occhio o del fegato). Gli effetti terapeutici terminano con la morte del paziente e non sono trasmissibili alla progenie.
  • Terapia genica germinale: Consiste nella modifica delle cellule della linea germinale (gameti o embrioni allo stadio precoce). La variazione genica viene integrata nel genoma in modo permanente e trasmessa alle generazioni future. Questa metodica solleva gravissimi problemi etici legati all’alterazione artificiale dell’evoluzione umana ed è attualmente vietata in clinica.

Requisiti Fondamentali (Occorrente)

Per implementare un protocollo di terapia genica efficace sono necessari:

  1. Gene clonato: La sequenza del gene deve essere isolata e manipolabile in vitro.
  2. Vettore idoneo: Poiché i geni genomici interi (contenenti esoni e introni) sono troppo lunghi (ordine delle megabasi), si introduce esclusivamente il cDNA (DNA complementare privo di introni), dimensionato in base alla capacità di carico del vettore.
  3. Espressione permanente: Il costrutto deve integrarsi stabilmente nel genoma ospite per evitare che venga perso durante le divisioni cellulari (l’espressione episomale extragenomica è solo transitoria).
  4. Sistema di controllo trascrizionale: Presenza di promotori costitutivi forti (es. LTR virali) o tessuto-specifici per assicurare adeguati livelli di trascrizione.
  5. Sicurezza inserzionale: Il gene non deve integrarsi in siti genomici critici (es. all’interno di oncosoppressori, attivando oncogeni o finendo in regioni eterocromatiniche che ne causano il silenziamento).
  6. Beneficio clinico reale a fronte di un costo ragionevole (le terapie cellulari avanzate come le CAR-T presentano costi elevatissimi, fino a 3-4 milioni di euro, dovuti alla complessa logistica di trasporto e manipolazione cellulare).

Tipologie di Approccio Veicolativo

1. Approccio Ex Vivo

Prevede il prelievo di cellule dal corpo del paziente, la loro manipolazione genetica e selezione in vitro, la loro espansione clonale e il successivo reimpianto nel paziente.

  • Applicazioni: È l’approccio preferenziale per le malattie del sistema ematopoietico (es. Beta-Talassemia), in cui si isolano dal midollo osseo le cellule staminali esprimenti il marcatore CD34+, le si trasfetta con il vettore terapeutico e le si reinfonde nel paziente.
  • Vantaggi: Massima sicurezza e controllo dell’integrazione genica prima del reimpianto.

2. Approccio In Vivo

Consiste nell’inoculazione diretta del vettore terapeutico all’interno dell’organismo (sistemica tramite circolo sanguigno o locale nell’organo bersaglio).

  • Applicazioni: Utilizzato per organi non prelevabili (es. polmone nella Fibrosi Cistica, retina).
  • Svantaggi: Bassa efficienza di trasfezione e ridotta selettività, sebbene mitigata sfruttando il tropismo naturale di alcuni vettori per specifici tessuti.

Tipologie di Vettori

I vettori si dividono in vettori virali e sistemi non virali.

1. Vettori Virali

Sfruttano la naturale capacità infettiva dei virus per introdurre il materiale genetico all’interno delle cellule ospiti. I geni virali replicativi e patogeni (es. nei retrovirus i geni GAG per il capside, POL per la trascrittasi inversa ed ENV per l’envelope) vengono rimossi e sostituiti dal cDNA terapeutico affiancato dalle sequenze regolatrici LTR e dal segnale di packaging (psi).

  • Produzione (Cellule di Packaging): Per produrre i virioni ricombinanti infettivi ma geneticamente difettivi (incapaci di replicarsi una volta penetrati nella cellula ospite), si utilizzano in vitro le cellule di packaging. Queste cellule contengono i geni strutturali del virus integrati nel proprio genoma ma privi del segnale : producono quindi le proteine del capside e del rivestimento che riconoscono ed impacchettano esclusivamente il cDNA terapeutico (provvisto di segnale ) introdotto per trasfezione.
  • Principali Classi di Vettori Virali:
    • Retrovirus: Si integrano stabilmente nel genoma ospite ma in modo del tutto casuale (rischio di mutagenesi inserzionale). Infettano esclusivamente cellule in attiva divisione.
    • Lentivirus: Sottoclasse dei retrovirus in grado di infettare e integrarsi anche in cellule che non si dividono.
    • Adenovirus: Non si integrano nel genoma (rimangono in forma episomale, espressione transitoria) e inducono una fortissima risposta immunitaria ed infiammatoria.
    • Virus Adeno-Associati (AAV): Vettori molto sicuri che mostrano un’integrazione sito-specifica preferenziale a livello del cromosoma 17 (riducendo il rischio di inserzioni nocive). Hanno tuttavia una capacità di carico limitata (cDNA corti).

Caratteristiche del Vettore Virale Ideale:

  • Capacità di infettare sia cellule replicanti che post-mitotiche/non replicanti (es. difficoltà nel trattare il tessuto muscolare nella Distrofia Muscolare di Duchenne e Becker).
  • Integrazione in un’unica posizione genomica nota e sicura per evitare mutagenesi.
  • Tropismo specifico per il tessuto patologico bersaglio.
  • Espressione controllata e ad alti livelli del transgene.
  • Assenza di immunogenicità.
  • Capacità di ospitare cDNA di grandi dimensioni.

2. Vettori Non Virali

Presentano un’efficienza di trasfezione generalmente inferiore ma sono sicuri dal punto di vista immunologico. Rappresentano circa il 30% dei vettori correntemente utilizzati.

  • DNA nudo: Inoculazione diretta di plasmidi contenenti il gene d’interesse; efficacia minima.
  • Gene Gun (Pistola genica): Microparticelle d’oro rivestite di DNA sparate ad alta velocità nei tessuti; penetrazione molto localizzata e superficiale.
  • Liposomi (Lipoplex): Vescicole lipidiche bilamellari sintetiche che racchiudono il DNA nel loro core idrofilo. Facilitano l’ingresso cellulare fondendosi con la membrana plasmatica o per endocitosi mediata da clatrina. La presenza di specifici lipidi neutri impedisce la degradazione lisosomiale, consentendo il rilascio del DNA nel citoplasma, da cui migrerà nel nucleo cellulare per essere espresso.

Focus: La Tecnologia dei Liposomi nei Vaccini a mRNA

La tecnologia dei liposomi (lipoplex) ha costituito la base molecolare per lo sviluppo rapido dei vaccini anti-COVID-19 (Pfizer-BioNTech e Moderna). L’mRNA introdotto codifica per la proteina Spike virale ed è stato ottimizzato chimicamente per garantirne la stabilità nel citoplasma ed evitarne la rapida degradazione enzimatica:

  • Modificazione del 5’ cap.
  • Introduzione di sequenze stabili 5’ UTR e 3’ UTR.
  • Presenza di una coda poliA fissa e standardizzata.
  • Ottimizzazione della sequenza di Kozak per favorire l’inizio della traduzione da parte dei ribosomi.
  • Nota: A differenza della terapia genica classica per malattie ereditarie (che richiede un intervento stabile permanente “one shot”), nei vaccini l’espressione dell’mRNA deve essere transitoria e non integrata nel genoma. L’instabilità intrinseca dell’mRNA ha richiesto storicamente la conservazione a temperature criogeniche (circa -80°C).

Vantaggi e Svantaggi della Terapia Genica

Vantaggi:

  • Rappresenta una cura reale e risolutiva a livello eziologico del difetto genico, differenziandosi dalle terapie puramente palliative o di supporto.

Svantaggi:

  • Risposta immunitaria: La massiva reazione immunitaria contro i capsidi dei vettori virali rappresenta il rischio clinico più severo.
  • Mutagenesi inserzionale: Rischio di oncogenesi legata all’integrazione casuale del transgene nel DNA ospite.
  • Inapplicabilità alle malattie complesse: Le patologie multigeniche non beneficiano di questo approccio.
  • Considerazioni etiche: Rischi connessi all’eugenetica, alla selezione artificiale di caratteri fenotipici non patologici e alla manipolazione della linea germinale umana.

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