Cluster — Tecniche di Biologia Molecolare
Questo cluster raccoglie le principali metodiche analitiche e manipolative impiegate nei laboratori di ricerca pre-clinica e molecolare. Spazia dalla spettrofotometria quantitativa all’elettroforesi su gel (per acidi nucleici e proteine), copre la specificità di taglio degli enzimi di restrizione e descrive le applicazioni diagnostiche basate sull’ibridazione degli acidi nucleici con sonde marcate (Southern Blot, FISH citogenetica).
🔬 Analisi Quantitativa e Separazione Elettroforetica
- Spettrofotometria — La misurazione dell’assorbanza UV per quantificare la concentrazione e valutare la purezza dei campioni di acidi nucleici. → A differenza della spettrofotometria quantitativa, per valutare l’integrità e separare fisicamente le macromolecole si ricorre all’:
- Elettroforesi su Gel — La migrazione in campo elettrico attraverso gel d’agarosio (per DNA/RNA) o gel di poliacrilammide in presenza di SDS (per proteine/istoni core). → Quando però servono purificare un complesso macromolecolare e misurarne le proprietà fisiche (forma, dimensioni, peso molecolare) si ricorre alla separazione per sedimentazione:
- Centrifugazione su Gradiente di Saccarosio — La separazione di particelle per velocità di sedimentazione attraverso un mezzo a densità crescente; fu decisiva per caratterizzare il nucleosoma e dimostrare la stechiometria dell’ottamero istonico.
✂️ Manipolazione del DNA ed Ibridazione Molecolare
- Enzimi di Restrizione — Le endonucleasi batteriche che riconoscono e tagliano sequenze palindrome specifiche per mappare o clonare segmenti di DNA. → La proprietà biologica chiave di riassociazione spontanea di filamenti singoli complementari è alla base dell’:
- Ibridazione degli Acidi Nucleici — L’utilizzo di sonde a sequenza nota marcate per intercettare sequenze target complementari. → L’ibridazione condotta su frammenti elettroforetici trasferiti su membrana solida è il:
- Southern Blot — Tecnica per isolare e determinare la presenza e dimensione di specifiche bande di restrizione di DNA. → L’ibridazione mirata effettuata direttamente su vetrino con cromosomi metafasici o nuclei fissati è la:
- Ibridazione in situ Fluorescente (FISH) — Metodica di citogenetica molecolare per mappare anomalie numeriche o traslocazioni strutturali cromosomiche. → Saper distinguere presenza di sequenza da numero di copie è ciò che evita un errore diagnostico ricorrente, la:
- Falsa Omozigosi — La trappola del dropout allelico: perché la PCR qualitativa manca le delezioni eterozigoti e i metodi di dosaggio (FISH, Southern, MLPA) le smascherano.
🔗 Cluster correlati
- Cluster — Struttura degli Acidi Nucleici ed Esperimenti Storici — Tratta l’appaiamento complementare e la carica netta negativa dei fosfati che guidano la migrazione e l’ibridazione.
- Cluster — Proteine — Connesso per via dell’applicazione dell’elettroforesi SDS-PAGE nello studio dei complessi proteici ed istonici.
- Cluster — Duplicazione del DNA — L’elettroforesi viene utilizzata per separare i topoisomeri e saggiare l’attività delle topoisomerasi.