Sequenziamento Sanger e Approccio per Singolo Gene

Il sequenziamento del DNA

I test applicabili in un laboratorio di genetica molecolare sono moltissimi e indagano tipi molecolari diversi, ma il sequenziamento del DNA resta la forma più ampia di indagine: consultando il catalogo dei difetti molecolari associati a patologia nell’uomo, fino al 90% dei difetti molecolari identificabili può essere individuato con il sequenziamento. Per sequenziamento si intende la conoscenza fisica della successione dei nucleotidi all’interno di un tratto di DNA, di un gene o di un locus di interesse: una tecnica versatile, capace di identificare un ampio numero di difetti molecolari e quindi di dare una diagnosi molecolare in un ampio numero di pazienti.

Il metodo di Sanger

Il sequenziamento diretto di Sanger è stato per circa 40 anni il metodo di riferimento. Messo a punto alla fine degli anni ‘70, ha avuto il suo boom tra gli anni ‘80 e i primi anni 2000 e ha aperto il cosiddetto approccio per singolo gene: sequenziare direttamente un gene sospettato di essere legato a una patologia, con un costo non basso ma affrontabile. Fino a circa 15 anni fa quasi tutte le forme di malattia genetica oggi note sono state identificate con questo strumento.

Il suo utilizzo in forma massiva ha reso possibile il Progetto Genoma Umano, concluso nella prima fase di validazione dei risultati nel 2000: per la prima volta è stata conosciuta l’intera sequenza del genoma umano, cromosoma per cromosoma (la rifinitura da telomero a telomero è stata completata solo alcuni anni fa). Su questo successo si fonda ancora oggi la conoscenza delle malattie genetiche.

Limiti generali

• È legato al singolo gene. Posto il sospetto di malattia genetica si sceglie un gene e lo si testa: se si trova una variante patogenetica il lavoro è finito, altrimenti si passa al gene successivo, e poi al terzo, fino a esaurire la voglia o la disponibilità economica.
• Non cattura la complessità delle malattie genetiche. Non permette di esplorare il contributo di altri geni: una volta identificata una variante ragionevole l’analisi si fermava.
• Non è applicabile a un alto numero di pazienti e di geni. Teoricamente fattibile, ma non economicamente efficiente.
• È risequenziamento. Si analizza una regione di DNA nota e la si confronta con la sequenza di riferimento del Progetto Genoma Umano, per vedere se è conforme o se rappresenta una variante (comunemente chiamata mutazione, termine oggi meno utilizzato), eventualmente associabile alla clinica del paziente.

Limiti specifici nelle malattie neuromuscolari e neurologiche

• Alta prevalenza complessiva. Anche le forme genetiche considerate rare, nel loro insieme, sono molto più frequenti di quanto stimato inizialmente.
• Eterogeneità di locus. La stessa malattia può essere spiegata da difetti molecolari in molti geni diversi (vedi Distrofie Muscolari dei Cingoli (LGMD)).
• Espressività variabile. Il difetto di un singolo gene può tradursi in manifestazioni cliniche molto eterogenee: la correlazione genotipo-fenotipo si indebolisce e, visitando il paziente in ambulatorio, diventa difficile ipotizzare quale gene indagare — un problema decisivo se l’approccio è quello del singolo gene.
• Geni di grandi dimensioni e complessità. Nelle malattie neuromuscolari si trovano alcuni tra i geni più grandi e complessi del genoma, di fatto largamente inesplorati fino all’avvento del sequenziamento di nuova generazione.
• Repertorio genetico molto ampio. Nelle sole malattie neuromuscolari si contano oltre 1200 condizioni cliniche legate a circa 700 geni, con una ventina di nuovi geni implicati ogni anno; il ritmo è ancora più elevato considerando l’intero gruppo delle malattie neurologiche.

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