Approcci NGS - Pannello, Esoma Clinico, Esoma, Genoma

Gli approcci disponibili in ambito diagnostico sono quelli elencati qui sotto, tenendo presente che la tecnologia è in rapida evoluzione. Passando dal pannello al genoma aumentano le regioni indagate e il numero di varianti da interpretare, mentre tende a ridursi la qualità (copertura e profondità) con cui ciascuna regione viene letta (vedi Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS)).

Pannello di geni

Si esamina solo un gruppo di geni associati a una patologia: da due o tre fino a centinaia.

• Svantaggio: si restringe volutamente il campo d’indagine. Se si pensa che il paziente abbia una neuropatia non si analizzano i geni delle distrofie muscolari.
• Scarsa uniformità nella scelta dei geni da indagare (vedi sotto).
• Invecchia in fretta: ogni anno vengono identificate decine di nuove cause genetiche, mentre lo strumento resta aggiornato agli anni precedenti.

Disomogeneità tra i pannelli

Nel campo delle miopatie congenite, confrontando i pannelli proposti da tre consorzi di esperti — gruppi che rivedono i dati di letteratura e decretano quali geni vadano studiati per ciascuna condizione — l’intersezione è sorprendentemente piccola: il numero di geni condivisi è estremamente basso.

Non esistono quindi linee di riferimento su quali geni analizzare, e ogni centro decide in modo sostanzialmente autonomo. Un paziente può arrivare con un referto prodotto altrove in cui sono stati analizzati alcuni geni, mentre il nostro centro ritiene necessario analizzarne altri: si torna così sul test genetico. Il test genetico non è una risposta definitiva e permanente.

Workflow del sequenziamento dell’esoma (parte 2): gli esoni bersaglio vengono arricchiti, eluiti e amplificati con PCR mediata da ligazione, poi sequenziati ad alta processività. Fonte: Wikimedia Commons (SarahKusala, CC BY 3.0).

Pannello allargato (esoma clinico)

Non solo i geni legati a una specifica malattia, ma tutti i geni connessi a patologia genetica nell’uomo. Chiamato anche mendelioma (termine che il docente non apprezza); il termine più appropriato è esoma clinico.

È un test versatile, applicabile in varie specialità: può rispondere al sospetto di malattia genetica del cardiologo, del nefrologo o del neurologo, costituendo un singolo test declinabile in discipline diverse — utile in un grande ospedale multispecialistico come il Policlinico di Milano. Produce un numero di varianti da interpretare più elevato rispetto al pannello.

Esoma

Sequenziamento di tutte le regioni codificanti del genoma, sia dei geni già noti come geni malattia sia di quelli non ancora identificati come tali. Approccio limitato alle regioni codificanti, ma esteso a tutti i geni. Il numero di varianti è significativamente più alto e il grado di copertura potrebbe non essere ottimale: più cose si vogliono vedere, minore tende a essere la qualità con cui si vedono, a meno di investire cifre significative su un singolo paziente, cosa non sempre possibile in un setting diagnostico.

Vantaggio decisivo: la rianalisi dei campioni. Essendo stati analizzati tutti i geni codificanti per proteine, se un nuovo gene malattia viene scoperto l’anno successivo si può tornare su un esame già esistente e verificare se il paziente presentava varianti in quel gene. Gli studi stimano un guadagno del 15% di diagnosi nei due anni successivi all’esoma. L’analisi è a costo zero — la sequenza è già stata prodotta — quindi vale sempre la pena rianalizzare i campioni.

Genoma completo

Conoscenza dell’intera sequenza nucleotidica dell’individuo: è il test più ampio oggi disponibile. Eseguibile anche in setting diagnostico, ma poche aziende ospedaliere lo usano di routine.

• Il numero di varianti è ancora più elevato, perché vengono interrogate anche le regioni non codificanti (introni).
• Utile, come l’esoma, per identificare nuovi geni malattia e per la rianalisi.
• Aspetto più importante: permette di verificare tipi mutazionali diversi dal semplice difetto di sequenza, come le alterazioni del numero di copie o gli effetti da espansione. Non in tutti i casi, ma con un guadagno ulteriore.
• Tecnicamente richiede oggi circa 2-3 giorni e un costo medio di 1.000 dollari di soli reagenti. Per confronto, il Progetto Genoma Umano è costato 10 miliardi di dollari per sequenziare il DNA di 7 individui, poi usati per anni come riferimento per l’intera popolazione mondiale.

Codici di richiesta

I codici di nomenclatura della Regione Lombardia per la richiesta di test genetici distinguono i test diretti (per esempio nel campo delle distrofinopatie: Duchenne e Becker) dagli approcci NGS per fasce di geni (singolo gene / da 2 a 10 / da 11 a 46 / oltre), che corrispondono a codici di rimborso diversi. Esistono codici anche per l’esoma completo e il genoma completo, sia per il singolo individuo sia per il trio (paziente e genitori), particolarmente utile nei casi pediatrici.

🔗 Collegamenti

• Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS) — 📋 fa parte di
• Indicazioni al Test NGS (Quando Richiederlo e Quando No) — ⬆️ scelta dell’esame
• Interpretazione delle Varianti (Criteri SIGU e Classificazione ACMG) — ➡️ passo successivo
• Nuove Frontiere della Diagnosi Genetica (Long-read, Trascrittomica, Proteomica) — ➡️ evoluzione tecnologica
• Resa Diagnostica dell’NGS nelle Malattie Neuromuscolari — 🔬 resa dei diversi approcci