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Referto NGS (Struttura, Checklist e Falsi Negativi)

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Referto NGS (Struttura, Checklist e Falsi Negativi)

Struttura del referto

Gli aspetti formali che si ritrovano in un referto genetico sono:

  • titolo;
  • indicazione al test;
  • tecnica utilizzata;
  • dati di copertura e profondità;
  • geni indagati;
  • risultati: descrizione di quanto trovato relativamente al gene di interesse per quel paziente;
  • interpretazione: chi redige il referto fornisce informazioni dalla letteratura o dai database interni sul ruolo patogenetico della variante (vedi Interpretazione delle Varianti (Criteri SIGU e Classificazione ACMG));
  • conclusione: inquadramento della coerenza tra la variante e la presentazione clinica del paziente, con l’invito a eseguire test ulteriori e a riferirsi sempre alla consulenza genetica o specialistica.

Chiamata di una variante (SNV) dalle reads NGS allineate sul riferimento: possibile variante eterozigote, con alcune reads che portano G e altre A (allele di riferimento A). Fonte: Wikimedia Commons (Benno89, CC BY-SA 3.0).

Checklist di lettura

Domande da porsi per verificare la bontà del dato:

  1. Il pannello contiene tutti i geni di interesse per la condizione clinica sospettata, oppure qualcosa non è stato analizzato?
  2. La presentazione clinica è inquadrabile con la variante trovata? (L’NGS non vede le patologie da espansione.)
  3. La profondità di lettura del campione è adeguata?
  4. Il dato è di qualità dal punto di vista tecnico?
  5. È stata condotta una validazione della variante?

La conoscenza genetica è in evoluzione: un referto di anni fa può non contenere informazioni su geni che oggi conosciamo.

La domanda più importante resta se le varianti individuate sono in accordo con la presentazione clinica. Nel caso più fortunato la variante ha una storia in letteratura e permette di trarre conclusioni su decorso, penetranza ed espressione della malattia.

Referto negativo: le cause di falso negativo

Quando il referto non contiene varianti dichiarate patogenetiche, le condizioni che possono generare un falso negativo e le relative contromisure sono:

  1. Il gene malattia non è incluso nel pannello → allargare l’indagine con un test più ampio, fino al genoma completo.
  2. Ridotta copertura delle zone di interesse del gene. Non tutte le regioni genomiche vengono analizzate con la stessa qualità → verificare che la regione codificante sia ben coperta e, se non lo è, ricorrere a una tecnica più appropriata come il vecchio sequenziamento di Sanger.
  3. Tessuto o tecnica non idonei. Alcune mutazioni vanno indagate su un tessuto particolare: le varianti mitocondriali si analizzano meglio sul tessuto post-mitotico estratto dal muscolo.
  4. Difetto molecolare in una regione non codificante, per esempio un introne con impatto sullo splicing.
  5. Difetto non rilevabile dal principio tecnico del test usato → allargare il tipo di analisi fino al genoma.
  6. Patogenicità della variante non chiara → analisi dell’intero gene e altre tecniche per aumentare lo score di patogenicità.
  7. Il gene malattia non è ancora stato scoperto.

Referto veramente negativo

Può succedere che il referto sia realmente negativo e che il paziente non abbia una malattia genetica: anche questo è un risultato guadagnato. In quel caso si rivaluta il paziente con ulteriori analisi di laboratorio e strumentali. Negli adulti si richiede spesso, se non è stata fatta, la biopsia muscolare per escludere le miopatie da statine, iatrogene e autoimmuni, che lasciano un’impronta sul muscolo senza avere una correlazione genetica.

Gli studi funzionali possono rafforzare la validità patogenetica della variante individuata, ma non sono disponibili in tutte le strutture sanitarie: solo in alcuni centri di ricerca. È questa la differenza tra un’indagine semplice e un’indagine complessa.

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