Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS)

Principio

La rivoluzione è avvenuta circa 15-20 anni fa. Indipendentemente dal protocollo e dalla metodica utilizzata, l’idea è arricchire contemporaneamente, a partire dal DNA di un individuo, molte regioni genomiche sequenziate in parallelo. Il DNA di ciascun individuo viene legato ad adattatori con sequenze che lo identificano in modo univoco (DNA barcoding): a ogni regione genomica studiata di quell’individuo viene associata una sequenza di nucleotidi che ne distingue l’origine.

Nello stesso esperimento — la stessa run di sequenziamento — si possono quindi mettere insieme decine o centinaia di pazienti diversi: un approccio molto ampio in termini di copertura e molto efficiente dal punto di vista economico, perché permette di analizzare migliaia di geni in centinaia o migliaia di soggetti contemporaneamente.

I dati di sequenza vengono poi tradotti nella successione dei nucleotidi, confrontati con la sequenza di riferimento e analizzati — l’approccio bioinformatico è oggi fondamentale per ottenere risultati di qualità — fino ad arrivare a una lista di varianti presenti nel paziente, da verificare nei geni di interesse per l’eventuale diagnosi molecolare.

Copertura e profondità di lettura

Tutti gli approcci di nuova generazione sono caratterizzati da due valori, che compaiono sul referto e vanno sempre verificati:

• Copertura (coverage): rapporto tra il numero di basi effettivamente lette e quelle che ci si era prefissati di leggere. Leggere tutti i nucleotidi di tutti gli esoni di un gene significa copertura del 100% della regione codificante.
• Profondità di lettura: quante volte il singolo nucleotide viene letto nell’esperimento. Maggiore è la profondità, maggiore è la confidenza nell’identificazione di una variante.

Un dato di qualità (copertura ampia e profondità elevata) richiede una capacità di sequenziamento che si scontra con i costi: non è possibile avere valori sempre elevatissimi in ogni tipo di approccio. Maggiore è il numero di pazienti indagati nella stessa run, minore è la profondità di lettura ottenuta per le singole regioni.

In un referto NGS di un paziente con sospetta distrofia muscolare, nella sezione “risultati” compaiono due varianti patogenetiche nel gene Calpaina 3 (associato a una forma recessiva di distrofia muscolare): il gene è stato interrogato con copertura del 100% e la variante riportata come esempio ha profondità di lettura 281, valori adeguati perché l’analisi di quel gene sia informativa.

A cosa serve un esame NGS

• Aumenta il numero di diagnosi molecolari, con vantaggi effettivi per il paziente.
• Permette un follow-up efficace. In alcune forme di distrofia dei cingoli c’è un chiaro coinvolgimento cardiaco, che può non essere presente all’esordio e svilupparsi in seguito: sapere quale forma ha il paziente permette di impostare un follow-up cardiologico.
• Dà accesso alle terapie o ne consente il miglioramento. Nella malattia di Pompe, una glicogenosi di tipo II, sono disponibili più terapie efficaci, fra cui la terapia enzimatica sostitutiva che combina un enzima ricombinante con una molecola farmacologica.

• Dà accesso ai trial clinici e riduce il ritardo e le odissee diagnostiche: il paziente non deve spostarsi tra ospedali diversi per eseguire il corollario di esami che un tempo guidava l’analisi genetica.
• Riduce la richiesta di esami supplementari, in alcuni casi invasivi.
• Migliora la scoperta di nuovi geni malattia. Qui non si è nel campo della diagnosi ma dell’espansione della conoscenza. Nelle malattie mitocondriali lo spartiacque è stato il primo gene identificato come causa attraverso analisi NGS: nell’era pre-NGS i geni scoperti erano il frutto di 25 anni di lavoro, oggi ne vengono implicati in media 15-20 ogni anno.

Il singolo paziente diventa informativo

Prima dell’NGS, identificare una nuova causa genetica richiedeva grandi famiglie con molti membri affetti dalla stessa condizione, su cui condurre analisi di associazione, mappe di omozigosi e studi di linkage: si identificava una regione cromosomica, talvolta molto ampia, che veniva poi interamente sequenziata fino a trovare il difetto. Nelle malattie neurologiche e neurodegenerative la disponibilità di DNA delle generazioni ascendenti era spesso impossibile, perché i familiari erano già deceduti.

Oggi ogni paziente, da solo o con un piccolo gruppo familiare — il paziente e i suoi due genitori costituiscono il trio — ha un elevato potere informativo: sequenziando l’intera regione codificante (esoma) o l’intera sequenza di DNA (genoma) il difetto viene identificato in modo più semplice e rapido.

Medicina traslazionale

Il laboratorio si occupa anche di identificare nuovi difetti genetici: per un gene legato a una forma di miopatia congenita e per una chinasi coinvolta in una miopatia mitocondriale, l’uso di modelli cellulari derivati dal paziente ha permesso di testare approcci di terapia farmacologica efficaci almeno in vitro.

È la dimostrazione che la ricerca in genetica molecolare realizza almeno in parte la promessa della medicina traslazionale: si parte dal paziente, si trova il difetto genetico, si mettono a punto modelli per sviluppare terapie derivate dalla conoscenza del difetto molecolare, e quei farmaci possono poi essere portati all’uso umano — con tempi molto più brevi rispetto allo sviluppo canonico di nuove terapie. È anche il motivo per cui l’industria farmaceutica si sta orientando verso le malattie rare, dove i guadagni terapeutici (e economici) possono essere consistenti.

🔗 Collegamenti

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