FISH

La FISH (fluorescence in situ hybridization) è una tecnica di Citogenetica Molecolare che ha una risoluzione di circa 150 kb, superiore a quella del bandeggio.

Principio

La FISH si basa sull’appaiamento di sequenze complementari, lo stesso principio del Southern Blot. Si parte da DNA denaturato e da una sonda marcata a fluorescenza che riconosce esattamente una sequenza complementare. La differenza rispetto al Southern Blot è che il templato riconosciuto dalle sonde corrisponde ai cromosomi (preparato cromosomico).

Si prelevano i cromosomi da una cellula in metafase (come per il Cariotipo e il bandeggio) e li si denatura, così che il doppio filamento si apra e possa avvenire l’ibridazione. La tecnica non richiede necessariamente DNA metafasico: si può studiare anche il DNA di cellule in interfase o le fibre cromatiniche.

Dopo l’ibridazione si lava il vetrino (eliminando le sonde non appaiate) e lo si osserva al microscopio ottico a fluorescenza: il microscopio eccita le molecole fluorescenti, che emettono una lunghezza d’onda corrispondente a un certo colore.

Tipi di sonde

• Sonde WCP (whole chromosome paints) o “chromosome painting” → riconoscono in maniera specifica l’intero cromosoma.
• Sonde PCP (partial chromosome paints) → riconoscono solo un segmento cromosomico.
• Sonde complementari a sequenze ripetute, che si dividono in:
  • Sonde centromeriche → complementari al DNA alfoide, si appaiano al centromero del cromosoma.
  • Sonde complementari al DNA satellite.
• Sonde locus specifiche → complementari a sequenze uniche o a regioni specifiche associate a Patologie Genomiche presenti sul cromosoma.

Chromosome painting e M-FISH

Per generare una sonda chromosome painting si segue una metodica precisa: si prendono cellule bloccate in metafase e le si rompe, ottenendo una sospensione di cromosomi. I cromosomi vengono colorati con due diversi coloranti e fatti passare attraverso una sorta di spettrofotometro, che li separa in base a grandezza e quantità di fluorocromo. Si seleziona così un singolo cromosoma, lo si amplifica con primer per aumentarne il numero di copie, e con una seconda amplificazione si inseriscono i fluorocromi, ottenendo sonde dell’intero cromosoma marcate a fluorescenza.

Una potenzialità della FISH è poter utilizzare più sonde e più fluorocromi contemporaneamente. Si parla di M-FISH (multicolor-FISH) quando si marcano i cromosomi con più sonde, ognuna con una diversa combinazione di fluorocromi. La M-FISH era stata pensata per l’analisi dei tumori: la maggior parte delle cellule tumorali non si ferma in metafase, quindi sui pochi campioni disponibili si applicano più sonde per osservare i vari riarrangiamenti cromosomici.

Nell’immagine tutti i cromosomi sono marcati con 23 sonde diverse, ognuna con una differente combinazione di fluorocromi (5 in totale).

Sonde centromeriche

Le sonde centromeriche sono ancora usate in diagnostica. Il loro utilizzo è possibile perché il centromero umano, a differenza di quello dei cromosomi degli scimpanzé, presenta un’organizzazione di sequenze ripetute tipica di un singolo cromosoma specifico. Usando una sonda con una specifica sequenza di unità ripetute si individua quindi un cromosoma specifico. Questa condizione non vale per tutti i cromosomi, ma per la maggior parte.

Le sonde centromeriche sono formate da DNA alfoide e riconoscono una sequenza centromerica specifica. Sono importanti in diagnosi prenatale e postnatale per identificare i marcatori sovrannumerari.

iFISH (FISH interfasica)

La FISH invia segnali sia su DNA in metafase sia su DNA in interfase (in cui non si osservano i cromosomi). Quando non c’è tempo per allestire le metafasi da un campione di sangue (ci vogliono almeno 14 giorni), si esegue la iFISH, ovvero la FISH su cellule in interfase: basta mettere sul vetrino le cellule prelevate e in 2 giorni si hanno i risultati.

Con la iFISH si perdono però delle informazioni rispetto alla FISH su metafase: non si conosce la morfologia del cromosoma da cui proviene il segnale. Per questo si utilizza sempre una sonda di controllo, per essere sicuri che l’ibridazione sia avvenuta correttamente.

La iFISH viene usata di solito per evidenziare la presenza di aneuploidie e si applica nelle diagnosi prenatali per verificare la trisomia dei cromosomi 13, 18 o 21 o dei cromosomi sessuali. Le sonde impiegate sono di solito sonde locus specifiche.

Fino a poco tempo fa (ora non più) la iFISH veniva usata su amniociti non coltivati: quando arriva il prelievo per la diagnosi prenatale, gli amniociti vengono messi in coltura e si attende 10-15 giorni per fare il cariotipo; in caso di forte sospetto di trisomia si poteva richiedere una iFISH sugli amniociti ancora prima di coltivarli.

Nell’immagine in basso a sinistra si osserva un caso di trisomia 13 (3 segnali rossi anziché 2).

Sonde a sequenza specifica (locus specifiche)

Le sonde a sequenza specifica permettono di identificare singole regioni non ripetute presenti su un cromosoma, evidenziando una regione deleta o duplicata. Possono essere usate per marcare i marcatori sovrannumerari.

Un esempio sono le sonde subtelomeriche, complementari alle regioni subtelomeriche (subito adiacenti ai telomeri) di un determinato cromosoma. Il 5% dei pazienti con disabilità intellettiva di causa non nota presenta un riarrangiamento/traslocazione sbilanciata che coinvolge le estremità telomeriche. Spesso con il bandeggio questi riarrangiamenti non si vedono, quindi si usano le sonde locus specifiche per verificare se c’è una copia in più o in meno della regione di interesse che giustifichi il fenotipo patologico.

Esempi di applicazione

Traslocazione sbilanciata 2/16 (sonde subtelomeriche). In una famiglia, il probando presenta una traslocazione sbilanciata tra cromosoma 2 e 16: ha un pezzo di cromosoma 16 in più e un pezzo di cromosoma 2 in meno (trisomia parziale del 16 e monosomia parziale del 2), condizione patologica. La traslocazione era presente nella madre in forma bilanciata (un pezzo del 16 sul 2 e viceversa); il padre è sano. Nel ramo materno, oltre ad altri individui con fenotipo patologico, sono presenti aborti spontanei/nati morti, dovuti a una condizione più grave (trisomia parziale del 2 e monosomia del 16).

Stesso cariotipo con sonde diverse. Lo stesso cariotipo viene marcato con: a) sonde centromeriche; b) sonde subtelomeriche; c) sonde chromosome painting; d) sonde centromeriche + sonde complementari a sequenze pericentromeriche. Il marker (indicato dalla freccia) corrisponde a un Cromosoma ad Anello.

Duplicazione del braccio corto del cromosoma Y. La FISH conferma una diagnosi clinica in un paziente maschio azoospermico. Il cariotipo mostra un cromosoma Y di forma particolare; marcandolo con una sonda per il braccio corto p compaiono due segnali alle estremità, indicando due copie del braccio p: si tratta di un Isocromosoma del Y. Questo isocromosoma ha 2 copie del gene SRY (sede sul braccio breve) ma manca dei bracci lunghi, dove si trovano i geni della spermatogenesi: ciò spiega l’azoospermia.

Applicazione ai tumori

In oncoematologia la FISH è molto usata. Dopo il cariotipo si utilizzano sonde che coprono le regioni coinvolte nei break-point per verificare ed eventualmente escludere traslocazioni cromosomiche.

Fusione genica BCR-ABL. Esistono riarrangiamenti specifici che innescano la tumorigenesi. La fusione tra le sequenze ABL (un protooncogene) e BCR forma un gene chimerico che codifica per una tirosin-chinasi attivata continuamente. La FISH verifica la fusione usando una sonda rossa per una sequenza e una verde per l’altra: se i due segnali appaiono insieme o molto vicini, la fusione è avvenuta. Identificata la fusione, si sa che c’è una tirosin-chinasi sempre attiva e la si può bloccare/inibire con farmaci specifici: la FISH guida quindi la scelta della terapia.

Traslocazioni del locus delle immunoglobuline. Molte traslocazioni coinvolgono il locus che codifica per la catena pesante delle immunoglobuline: un protooncogene viene spostato vicino al gene delle catene pesanti e ne utilizza l’enhancer per essere espresso.

Amplificazione di MYC. Come indice di progressione tumorale si ha l’amplificazione dell’oncogene MYC, dovuta alla duplicazione di queste sequenze. Si formano piccoli marcatori sovrannumerari detti double minutes. Per verificare la progressione si esegue una FISH sulle cellule tumorali con una sonda per la sequenza MYC (in rosso) e una sonda di controllo chromosome painting (in verde) per il cromosoma 8 (sede originaria di MYC): numerosi segnali rossi indicano molte copie di MYC e quindi uno stato tumorale avanzato.

L’amplificazione di MYC può portare anche a cromosomi aberranti: il numero di copie aumenta a tal punto che il cromosoma cambia forma, presentando regioni dette HSR (homogeneously staining regions), anch’esse individuabili con sonde fluorescenti.

I double minutes sono copie di MYC come DNA extracromosomico (non associato ai cromosomi), mentre le HSR sono molte copie del gene MYC all’interno del cromosoma. Entrambi sono indicatori di progressione tumorale. Oltre a MYC, nei tumori vengono amplificati anche altri geni, come il protooncogene NMYC.

🔗 Collegamenti

• Citogenetica Molecolare — 📋 fa parte di
• Cariotipo — 🔗 stesso meccanismo / stessa via
• Patologie Genomiche — 🔬 reperto diagnostico
• Cromosoma Marcatore — 🔬 reperto diagnostico
• Aneuploidia — 🔬 reperto diagnostico
• Isocromosoma — 🔬 reperto diagnostico
• Array-CGH — 🔄 confronto